鮮義坤，李 果，李裕冬，王承東，熊鐵一，張貴權(quán)*

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都 610015；2.大熊貓國家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國大熊貓保護(hù)研究中心，四川 臥龍 623006）

大熊貓屬我國特有的、世界著名的萌寵珍稀動(dòng)物。目前人工飼養(yǎng)的大熊貓母獸胎產(chǎn)仔成活數(shù)最高記錄為3只，約50%的產(chǎn)仔大熊貓產(chǎn)雙胞胎，產(chǎn)后泌乳量難以滿足2～3仔的快速生長發(fā)育需要，個(gè)別母獸甚至1 仔也不喂養(yǎng)[1-2]。這就需要用其他動(dòng)物乳汁或奶粉進(jìn)行補(bǔ)飼或全人工喂養(yǎng)。

頂空（HS）-固相微萃取（SPME）是用于分析揮發(fā)性化合物的一種前處理技術(shù)，氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）聯(lián)用技術(shù)可分離和鑒定樣品中的多種揮發(fā)性組分，HS-SPME與GC-MS的結(jié)合開創(chuàng)了國內(nèi)外分析未知混合型揮發(fā)性成分的新局面。我國科技工作者曾用HS-SPME-GC-MS 方法分析過羊乳和牛乳、豬乳、羊奶粉、羊奶粉和牛奶粉以及驢奶粉中的揮發(fā)性化合物或風(fēng)味物質(zhì)，為本項(xiàng)研究提供了可借鑒的方法[3-11]。本試驗(yàn)通過對(duì)大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉的揮發(fā)性成分分析，旨在探尋大熊貓幼仔食物中的香氣物質(zhì)，有助于揭示大熊貓幼仔喜歡的食物氣味及香氣物質(zhì)，也可為研制大熊貓幼仔專用誘食劑（即人造大熊貓乳源性化學(xué)信息素）提供原料選擇方面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供測奶粉

供測奶粉有兩種：奶粉A，為美國某企業(yè)生產(chǎn)；奶粉B，為我國某中外合資企業(yè)生產(chǎn)，屬嬰兒配方奶粉，適用于喂養(yǎng)0～6月齡的嬰兒。上述兩種奶粉均為中國大熊貓保護(hù)研究中心（簡稱大熊貓中心）用于補(bǔ)飼大熊貓幼仔多年。奶粉A 樣品采自大熊貓中心臥龍神樹坪基地，奶粉B從成都某超市購買，與大熊貓中心臥龍神樹坪基地飼喂的品牌、型號(hào)及適用月齡階段一致。

樣品移入已清洗干凈并經(jīng)濕熱高溫滅菌除味（高溫→室溫→高溫，熱冷間歇，重復(fù)3 次）的10 mL 棕色玻璃瓶中，旋緊瓶蓋，再用無味的封口膜纏繞瓶蓋與瓶頸結(jié)合處數(shù)圈確保密封，以防止奶粉氣味散失和環(huán)境氣味串入，置于-20 ℃冰箱中保存，待測。

1.2 分析儀器

GC-MS 聯(lián)用儀：QP 2010Plus（日本島津公司）。石英毛細(xì)管色譜柱：DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；20 mL 頂空瓶及其相應(yīng)的密封墊和鋁蓋；均由美國Agilent 公司出品。SPME 頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS；SPME 手動(dòng)進(jìn)樣手柄；均由美國Supelco 公司出品。其他器材用品均為測試分析室常規(guī)配置。

1.3 HS-SPME法

稱奶粉1 g入頂空瓶中，加5 mL去離子水，搖勻，再加NaCl 1.5 g，迅速用密封墊和鋁蓋密封，將已老化的萃取頭（250 ℃下老化）插入頂空瓶，將頂空瓶聯(lián)同萃取頭置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi)，固定，50 ℃平衡20 min，推出萃取纖維頭至離液面約1 cm處。50 ℃頂空萃取1 h?？s回萃取纖維頭，拔出后快速插入GC進(jìn)樣口，推出萃取頭解吸3 min。

1.4 GC-MS聯(lián)用分析

1.4.1 GC條件

柱箱溫度40 ℃，進(jìn)樣溫度270 ℃，進(jìn)樣模式不分流，進(jìn)樣時(shí)間1 min，載氣為高純氦氣，流量控制模式壓力49.5 kPa，總流量16.0 mL·min-1，柱流量1.0 mL·min-1，線流量36.1 cm·s-1，吹掃流量進(jìn)樣模式5.0 mL·min-1，分流比10.0；程序升溫模式的起始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃·min-1速率升至160 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1速率升至280 ℃，保持20 min。

1.4.2 MS條件

接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電離方式為EI，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～500 m·z-1。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

利用GC-MS 工作站軟件和自帶NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)。定性檢測需組分質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的匹配度≥80%，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時(shí)參照保留時(shí)間推定奶粉中的揮發(fā)性成分。定量檢測按峰面積歸一化法自動(dòng)計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。剔除從色譜柱和SPME頭上掉下的硅氧烷等“外來”物質(zhì)，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶粉A的揮發(fā)性成分

大熊貓幼仔兩種補(bǔ)飼奶粉中的揮發(fā)性成分見表1。大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉A 和奶粉B 中的揮發(fā)性成分總離子流色譜見圖1和圖2。

由表1、圖1 可見，奶粉A 共測出52 種揮發(fā)性成分，其中可推定的揮發(fā)性有機(jī)化合物有46 種，歸類于醇4 種、酚1 種、醛4 種、酮2 種、酯2 種、烷烴12種、烯烴6種、芳香烴14種、含硫化合物1種；烴類物質(zhì)較多，達(dá)32 種；有12 種成分曾在家畜乳汁（羊乳、牛乳或豬乳，下同）中檢出[4-7]。有15種成分也曾在家畜乳汁加工品——奶粉（羊奶粉或牛奶粉或驢奶粉，下同）中檢出[8-11]。奶粉A中相對(duì)含量排前5位的揮發(fā)性成分依次是己醛（34.40%）、1,2,3-三甲基苯（5.47%）、1-戊醇（4.42%）、2-乙基-1-己醇（4.02%）、1,2-二甲基苯（3.67%），合計(jì)達(dá)51.98%；據(jù)此認(rèn)為己醛可能對(duì)奶粉A 的香氣形成起到重要作用。

表1 大熊貓幼仔2種補(bǔ)飼奶粉中的揮發(fā)性成分

續(xù)表

圖1 大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉A中的揮發(fā)性成分總離子流色譜

圖2 大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉B中的揮發(fā)性成分總離子流色譜

2.2 奶粉B的揮發(fā)性成分

由圖2 和表1 可見，奶粉B 僅測出揮發(fā)性成分（已剔除硅氧烷等“外來”物質(zhì)）8種，其中可推定的揮發(fā)性有機(jī)化合物有6 種，歸類于醇1 種、醛2種、酮1 種、雜環(huán)化合物1 種、含硫化合物1 種，有4種成分曾在家畜乳汁中檢出[4-7]。有5種成分也曾在家畜乳汁加工品——奶粉中檢出[8,10-11]。奶粉B中相對(duì)含量排前5 位的揮發(fā)性成分依次是己醛（65.41%）、二甲基二硫醚（12.87%）、2-庚酮（5.83%）、1-戊醇（5.73%）、庚醛（有待進(jìn)一步確定，4.17%），合計(jì)達(dá)94.01%。據(jù)此認(rèn)為己醛可能也對(duì)奶粉B的香氣形成起到重要作用。

2.3 兩種奶粉中揮發(fā)性成分的異同分析

本試驗(yàn)結(jié)果表明，大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉A與奶粉B之間相同的成分有5種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、壬醛，而不同的成分多達(dá)40 種，且與文獻(xiàn)報(bào)道的家畜乳汁及其奶粉之間也存在一些差異[4-11]。這可能是因?yàn)椴煌N類的動(dòng)物乳源、不同的動(dòng)物日糧結(jié)構(gòu)以及與家畜乳汁和奶粉不同的具體分析方法如色譜柱的極性強(qiáng)弱、SPME 頭的型號(hào)不同等所致。雖然奶粉A 和奶粉B的相對(duì)含量最高的成分均為己醛，但因揮發(fā)性成分的數(shù)量相差較大，可能導(dǎo)致兩種奶粉間以及與家畜乳汁和奶粉在香氣類型或強(qiáng)度上有所不同。

2.4 兩種奶粉中香氣成分的異同分析

測出揮發(fā)性成分之后，再從中篩選出國內(nèi)外廣泛認(rèn)同的應(yīng)用性單體呈香物質(zhì)（即狹義上的香氣成分，下同），是探尋未知混合型物品中香氣成分的一種簡捷方法。從大熊貓幼仔2種補(bǔ)飼奶粉中測出的揮發(fā)性成分對(duì)人而言幾乎都有不同類型、不同強(qiáng)度的氣味，但有些氣味物質(zhì)對(duì)人或動(dòng)物的健康可造成不利影響，沒有通過甚至尚未進(jìn)行食品或飼料安全性試驗(yàn)與評(píng)估，不能用于食品級(jí)或飼料級(jí)香原料。不同國家或組織如歐盟的要求、標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)不盡一致，但基本認(rèn)可具有FEMA 編號(hào)的呈香物質(zhì)。由表1 可見，奶粉A 中的香氣成分有14 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、甲酸己酯、2-庚酮、庚醛、α-蒎烯、β-蒎烯、1-辛烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、2-苯基-1-丙醛、2-壬酮、壬醛、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；奶粉B 只有6 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、2-戊基呋喃、壬醛；奶粉A和奶粉B相同的香氣成分有5 種，分別是：二甲基二硫醚、1-戊醇、己醛、2-庚酮、壬醛；相互不同的香氣成分有10種，分別是：甲酸己酯、庚醛、α-蒎烯、β-蒎烯、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、2-乙基-1-己醇、2-苯基-1-丙醛、2-壬酮、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。因兩種奶粉的香氣成分?jǐn)?shù)量相差8 種，相互不同的香氣成分達(dá)10 種，據(jù)此推知這兩種奶粉的香氣類型和強(qiáng)度應(yīng)有一些差異，有待對(duì)這兩種奶粉的香氣進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 討 論

3.1 大熊貓幼仔喜歡的香氣物質(zhì)

表1 中具有FEMA 編號(hào)的揮發(fā)性成分是國際國內(nèi)公認(rèn)的、法規(guī)允許在加工類食品中使用并可合成和購買的單體呈香物質(zhì)。本次從奶粉A和奶粉B中共測出15 種香氣成分，對(duì)于奶粉的某種香氣類型而言如奶香和腥氣等有著或輕或重、或正或負(fù)的貢獻(xiàn)，其中1-戊醇、己醛、2-庚酮、庚醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、壬醛、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚也存在于圈養(yǎng)大熊貓乳汁中[12]。這8 種成分中可能部分或全部均為大熊貓幼仔喜歡的香氣物質(zhì)，但需要進(jìn)一步的單體香氣物質(zhì)飼喂試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 奶粉間揮發(fā)性成分的差異原因

表1是大熊貓幼仔兩種補(bǔ)飼奶粉在同一日期用同樣方法經(jīng)同臺(tái)儀器檢測的結(jié)果，但兩種奶粉揮發(fā)性成分差異較大，原因可能是用于加工奶粉的乳汁來自不同的動(dòng)物種類；用于加工奶粉的乳汁輔以其他非乳源性原料調(diào)配而成；即使乳源動(dòng)物的種類相同，而飼喂日糧組成不同；不同的奶粉生產(chǎn)工藝流程所致。本次分析只是初步測試，還不徹底，某些香氣成分的種類仍不全面，兩種奶粉中存在的香氣成分還有很多未被測出，有待通過不同的SPME溫度和時(shí)長、萃取纖維頭類型、GC-MS 型號(hào)、程序升溫、色譜柱類型和長度、譜庫版本等關(guān)鍵技術(shù)節(jié)點(diǎn)變化進(jìn)一步詳盡分析大熊貓幼仔補(bǔ)飼奶粉的揮發(fā)性成分尤其是香氣成分，以便更多地了解大熊貓幼仔食物中的香氣物質(zhì)，進(jìn)而揭示大熊貓幼仔喜歡的食物氣味和香氣物質(zhì)。

3.3 奶粉中香氣成分的應(yīng)用意義

本試驗(yàn)測試結(jié)果也為研制大熊貓幼仔專用誘食劑提供了部分原料選擇的參考依據(jù)。可根據(jù)大熊貓乳汁的風(fēng)味特征和參考上述測出的香氣物質(zhì)，模擬大熊貓乳汁的天然香氣，調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑，在功能上就是人工仿制大熊貓乳源性化學(xué)信息素，讓人工乳、代用奶等食物具有“媽媽”乳味，使幼仔進(jìn)食過程具有安全感、親切感以及幸福感，緩解從自然母乳向人工食物變換而引起的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)幼仔采食欲望[23]。

表1中具有FEMA 編號(hào)的單體呈香物質(zhì)的香氣特征如下：二甲基二硫醚具有強(qiáng)烈的、洋蔥、甘藍(lán)、玉米罐頭樣香氣，1-戊醇具有蘋果、香蕉、酵母、酒香香氣，己醛具有強(qiáng)烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣，甲酸己酯具有強(qiáng)烈的、青香、生水果香氣，2-庚酮具有水果、青香、奶油、奶酪香氣，庚醛具有脂肪、肉、尖刺的香氣，α-蒎烯和β-蒎烯均有松木、松節(jié)油樣香氣，1-辛烯-3-醇具有壤香、蘑菇、真菌、油膩、青香、蔬菜、肉香香氣，2-戊基呋喃具有果香、青香、壤香、骨粉香、根香香氣，2-乙基-1-己醇具有蘑菇香氣，2-苯基-1-丙醛具有青香、壤香、青葉香氣，2-壬酮具有脂肪、奶酪、青香、水果、花香香氣，壬醛具有脂肪、花香、蠟香、柑橘香氣，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）具有烘烤谷物香氣[24]。

上述15 種呈香物質(zhì)除2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚外均為我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760-2014）中允許在食品中添加使用的單體香原料，但2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚可用作部分加工類食品的抗氧化劑或防腐劑[14-15]。因此，在調(diào)制大熊貓幼仔專用誘食劑時(shí)可按照國家有關(guān)規(guī)定和要求酌情酌量有針對(duì)性地選用。