閆瑞，楊捷琳，陳翠玲，鈕冰，徐之雯，蔣原

(1.上海大學生命科學學院，上海 200444；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

0 引言

克諾羅桿菌原為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），隸屬于腸桿菌科[1-2]?？肆_諾桿菌屬（Cronobacter spp.）現(xiàn)包括7個種和3個亞種[1-3]，屬內菌株不同分型種類與臨床相關性存在較大差異，其中多數(shù)臨床分離株為阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C.malonaticus）。據(jù)報道，多數(shù)菌株易感染嬰幼兒和老年人等免疫力低下人群，可導致嚴重疾?。▔乃佬孕∧c結腸炎、敗血癥和腦膜炎），且致死率非常高（40%～80%）[4-6]。隨著克羅諾桿菌在不同食品尤其是嬰幼兒配方粉中被檢出而受到食品和衛(wèi)生監(jiān)管部門的高度重視[7,8]。

盡管人們已從食品、環(huán)境和臨床上分離到大量菌株，也對其分類有了較為清晰的認識。但是隨著越來越多克羅諾桿菌全基因組測序的完成，研究發(fā)現(xiàn)過去基于單個或多個基因的分型方法由于納入分析的信息有限，誤將許多無關菌株劃分到了一起[9,10]。因此利用全基因組測序（W hole genome sequencing，WGS）獲得的基因組數(shù)據(jù)，采用合適的分型方法來準確鑒定和快速識別不同來源的克羅諾桿菌能夠更為精確的將菌株進行分類，全基因組所提供的信息量在分類學中就顯得尤為重要。目前，已有許多方法可以分析全基因組測序數(shù)據(jù)，常用的3種方法[11]包括：基于k-m er統(tǒng)計的分析方法，單核苷酸多態(tài)性分析（Single nucleotide po ly-m orphism s，SNP）以及基于W GS的擴展的多位點序列分型方法即全基因組MLST。其中全基因組MLST具有較高的流行病學一致性、穩(wěn)定的菌株命名法和完善的數(shù)據(jù)庫，能夠實現(xiàn)國際標準化和可擴展性，分析速度快、辨識度高，計算要求復雜度低且相較于另外兩種分析方法無需生物信息專業(yè)知識。正是由于全基因組MLST具備上述諸多優(yōu)勢，使其成為國際食源性疾病監(jiān)測分子分型網絡（PulseN et International，http：//www.pu lsenetinternational.org/）標準化監(jiān)測的技術基礎[11-12]。

本研究中所采用的擴展的多位點序列分型方法是由Forsythe等[9]人建立的cogMLST分析方案，該方案主要是以C.sakazakii ES15菌株的直系同源基因簇作為參考基因組所定義的1865個基因座為基礎進行基因組序列比對分析，可以跨屬或選擇特定的物種或菌株進行比較。2014年Forsythe等[9]通過采用更具辨別力的編碼核糖體蛋白基因的多位點序列分析（ribosom al-MLST,rM LST）和基于直系同源基因簇核心基因的多位點序列（C lusters o f O rtho logous Genes-core geneM LST,COG-cgM LST）分析方法對107個克羅諾桿菌全基因組數(shù)據(jù)分析進一步證明C.sakazakii CC 4克隆譜系非常穩(wěn)健?，F(xiàn)在cogMLST可通過克羅諾桿菌PubM LST數(shù)據(jù)庫在線進行全基因組測序數(shù)據(jù)分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

克羅諾桿菌屬菌株信息收集自http：//pubm lst.org/cronobacter/，通 過 Cronobacter Pub MLST門戶網站https：//pubm lst.org/bigsdb?db=pubm lst_cronobacter_isolates，點擊查詢/瀏覽數(shù)據(jù)庫（Search or brow se database）選項下的基于7個位點的MLST方案獲取克羅諾桿菌的序列類型并將所有菌株來源信息以Excel文件格式導出，后通過Excel工作表中的數(shù)據(jù)篩選功能對菌株進行統(tǒng)計分析。

本研究中使用的菌株信息均來自C ronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫中的2 438株克羅諾桿菌屬菌株，包括阪崎克羅諾桿菌ST 1（67株），ST 4（95株），ST 13（43株）和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌ST 7（35株），具體信息見表1。表2列出了阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌中主要序列類型的國家來源概況。

1.2 建立本地數(shù)據(jù)庫

全基因組序列分析所需的240株菌株DNA序列收集自http：//pubm lst.org/cronobacter/，通過C ronobacter PubM LST門戶網站上的選項進行計算機分析，可訪問：https：//pubm lst.org/bigsdb?db=pubm lst_cronobacter_isolates。瀏覽并選取已完成全基因組測序的菌株以FASTA文件格式導出菌株的DNA序列信息。

1.3 7-loci MLST

菌株（2 400多株）的序列類型和克隆譜系通過Cronobacter Pub-MLST(https：//pubmlst.org/cronobacter/)的在線工具進行確定，訪問該網站并選擇序列比對（Sequence query）選項下的MLST方案即獲得相應的等位基因編號，ST和CC等比對信息。

1.4 cog MLST分析

首先通過Cronobacter Pub MLST（https：//pubmlst.org/bigsdb db=pubmlst_cronobacter_isolates）當中的“分析”（Analysis）選項下的基因組比較（Genome Comparator）選項進行提交所需分析菌株的完整DNA序列，后選用cog MLST方案依次重復獲取阪崎克羅諾桿菌ST1（67株），ST4（95株），ST 13（43株）和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌ST7（35株）菌株基因組的距離矩陣。矩陣以nexus文件格式導出并使用SplitsTree 4中的默認設置進行分析（UncorrectedP用于計算距離，并通過Neighbor Net構建網絡圖譜）。

2 結果與分析

2.1 克羅諾桿菌屬菌株統(tǒng)計結果

目前Cronobacter Pub MLST基因組和序列定義數(shù)據(jù) 庫（http：//pubmlst.org/cronobacter/）已 包 含 超 過2400多株菌株分離信息，其中C.sakazakii（1 774株）和C.malonaticus（295株）為該屬的優(yōu)勢菌種（表1）。通過將7-loci MLST應用于2 438株菌進行分析，共揭示了591種可定義的序列型（sequence type，ST），其中克諾羅桿菌C.sakazakii ST1（280株）、ST 4（334株）、ST 13（67株）和C.malonaticus ST7（78株）為主要序列型（表2）。截止2019年3月20日，數(shù)據(jù)庫中已有623株菌完成全基因組測序，包括C.sakazakii（438株）、C.malonaticus（82株）、C.dublinensis（56株）、C.turicensis（23株）、C.muytjensii（13株）C.universalis（9株）和C.condimenti（2株）。數(shù)據(jù)庫中最早的分離株為1950年分離自英國奶粉中的C.sakazakii，所有菌株共分離自全球40多個國家和地區(qū)。多數(shù)菌株分離自食品及配料當中，C.sakazakii和C.malonaticus與臨床及嬰幼兒配方奶粉密切相關。C.sakazaki i和C.malonaticus中主要序列類型的國家來源統(tǒng)計結果顯示，多數(shù)菌株分離自中國和美國（表1、2）。上述結果表明，由于MLST所針對的七個基因位點在基因組總量中占比較小，導致同一ST型中包含地理來源，分離時間，宿主等不相關的菌株，而對菌株溯源結果適得其反。

表1 Cronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫中的克羅諾桿菌菌株統(tǒng)計

2.2 C.sakazakii ST 1菌株的cog MLST分析

如圖1所示，67株阪崎克羅諾桿菌ST 1菌株的cog MLST聚類分析結果顯示，多數(shù)ST 1菌株基因組存在較大差異，22株于2014年分離自美國威斯康星州環(huán)境中的菌株聚集到了一起。值得注意的是，同樣分離自于2014年分離自美國俄勒岡州環(huán)境中的兩株菌（編號1344和1361）形成了另一分枝。67株ST 1菌株中最早的分離株（編號2522）在1987年分離自丹麥臨床當中與兩株分別源自愛爾蘭和加拿大臨床的菌株（編號1912和2536）聚集到了一起。兩株最新于2017年分離自丹麥臨床的菌株（編號2521和2573）卻與最早分離株（編號2522）存在較大差異。這些結果表明，阪崎克羅諾桿菌ST 1菌株的cogMLST聚類與菌株來源之間存在密切相關性。

2.3 C.sakazakii ST 4菌株的cog MLST分析

通過將cog MLST方案應用于95株阪崎克羅諾桿菌ST4菌株進行全基因組分析，結果如圖2所示，2014年分離自法國臨床及嬰幼兒配方奶粉的15株菌都聚集到了一起，3株源自2009年美國臨床的菌株（編號121、1163和1315）形成了一個單獨分枝。此外，一株于1997分離自年荷蘭臨床的菌株（編號1104）與另一株于2009年分離自瑞士臨床的菌株（編號2539）聚集到了一起。另外，最早于1950年分離自英國奶粉 的兩株菌則未與其它分離菌株形成明顯聚類。95株阪崎克羅諾桿菌ST 4菌株的cogMLST聚類分析結果表明，相同序列型菌株包含了大量非相關菌株，聚類與菌株來源之間存在一定關聯(lián)。

表2 C.sakazakii和C.malonaticus中主要序列類型的國家來源概況

圖1 C.sakazakii ST1菌株的cog MLST分析

圖2 C.sakazakii ST4菌株的cogMLST分析

2.4 C.sakazakii ST13菌株的cogMLST分析

如圖3所示，通過Cronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫中的cog MLST方案對43株阪崎克羅諾桿菌ST 13菌株分析顯示，在2005至2006年分離自中國進口乳制品當中的31株菌聚集到了一起，盡管這些乳品進口自6個不同的國家。這一結果與先前Guo等[13]人的SNP分析結果相一致——大多數(shù)菌株的SNP位點差異在20以內，因而可推測這些菌株存在克隆關系。值得注意的是，在Guo等[13]人的研究中的菌株CS-71（編號1999）因與參考菌株存在5387個SNP位點差異而與其它31株菌的基因組明顯不同。在此次研究當中，菌株CS-71也相對于高度克隆的31株菌形成了一個單獨分枝，并且與2016年分離自比利時臨床的菌株（編號2505）在基因組層面更為接近。此外，5株在1994年分離自法國臨床及嬰幼兒配方奶粉中的菌株也形成了一個獨立分枝。其余的5株菌則形成了五個不同的分枝。這些結果對于具有相同序列型但來源不同的菌株溯源分析及克隆關系的驗證將會有較大幫助。

2.5 C.malonaticus ST 7菌株的cogMLST分析

圖3 C.sakazakii ST13菌株的cogMLST分析

如圖4所示，35株丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌ST7菌株的cogMLST聚類分析結果顯示，最早在1973年分離自美國臨床的菌株（編號71）與1988年分離自新西蘭的菌株（編號1485）及2005年分離自韓國的菌株（編號145）基因序列差異較小。兩株于2010年分離自中國水環(huán)境中的菌株（編號1489和1491）聚集到了一起。此外，兩株來源于美國昆蟲當中分離時間為2012年的菌株（編號1842和1843）與另外兩株源自斯洛文尼亞臨床當中分離時間為2017年的菌株（編號2567和2568）分別形成了2個獨立分枝。1977年分離自美國臨床的兩株菌（編號590和1556）也相對于其它菌株形成了一個單獨的分枝。在2007年至2013年分離自捷克共和國（編號399和619）和斯洛伐克（編號415）臨床的菌株聚集到了一起，另外7株分離自捷克共和國臨床的菌株則形成了兩個小的分枝。這些結果表明，丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌ST 7菌株的cogMLST聚類與菌株來源之間存在密切相關性，這對于該序列型致病菌的流行病學調查研究將會有較大幫助。

圖4 C.malonaticus ST7菌株的cogMLST分析

3 討論

至今，分類學依舊是關于克羅諾桿菌研究的主題，因為準確的細菌分類對于可靠的監(jiān)管控制及溯源分析至關重要，而準確的細菌分類則依賴于有效的分型方法[3,9,14]。同時，無論是克羅諾桿菌的流行病學研究還是分子溯源方法的建立都必須基于對目標生物多樣性的透徹理解。

對于克羅諾桿菌屬各菌株之間的研究，7-loci MLST已被證實是一個非常有用的工具。最初Baldw in等[15]利用7-loci MLST成功地將C.sakazakii和C.malonaticus兩個種區(qū)分開來，同時結果顯示C.sakazakii ST 4菌株為優(yōu)勢菌株(22/60)。2012年Joseph等[16]采用7-loci MLST方法對325株克羅諾桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析進一步證實了7個種的存在。此外，還發(fā)現(xiàn)C.sakazakii是臨床來源的優(yōu)勢菌種，C.sakazakii ST 4是腦膜炎病例腦脊液分離株的主要序列類型。2014年Forsythe等[9]進一步對C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫中的1 007株克羅諾桿菌進行了7-loci MLST分析和統(tǒng)計。結果表明，C.sakazakii克隆復合物（clonal complexes，CC）4菌株與臨床來源密切相關，CC 1、CC 4和CC 7為主要序列型。2017年O grodzki等[17]繼續(xù)采用該方法對1 654株克羅諾桿菌進行了分型和來源分析。結果顯示，大多數(shù)臨床菌株為C.sakazakii CC 1和CC 4，ST 8和ST 12以及C.malonaticus ST 7型。此外，F(xiàn)ei等[18-20]也在近幾年持續(xù)利用這一方法對分離自中國市售奶粉及乳品廠的克羅諾桿菌污染情況進行了系統(tǒng)的調查分析，不僅揭示了多個主要序列型，而且證明了克羅諾桿菌在中國市售奶粉當中的污染依舊明顯。

由于7-loci MLST方法在克諾羅桿菌分型中的有效性，本研究使用7-loci MLST方法對C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫中已登記的2 438株菌進行了序列定義及統(tǒng)計分析。7-loci MLST共揭示了591種ST，其中ST1（280株）、ST4（334株）、ST 7（78株）和ST 13（67株）為主要序列型。多數(shù)菌株來源于食品及配料當中，并于1950至2017年分離自40多個國家。由于MLST所針對的七個基因位點在基因組總量中占比較小，導致同一ST型中包含地理來源，分離時間，宿主等不相關的菌株，而對菌株溯源結果適得其反。

全基因組測序由于獲得的序列信息量足夠大，是當前研究克羅諾桿菌分型最有效的方法，并可以對該致病菌進行精確的溯源[21-26]。關于克羅諾桿菌相同ST菌株的溯源分析之前已有研究[13,17,27-28]，M asood等[28]采用基于全基因組序列的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide po lym orphism,SNP）分型技術對1994年法國N ICU的C.sakazakii相同ST菌株進行了溯源分析，其結果顯示SNP分型方法可以對相同序列型菌株進一步分型，來自不同基因型簇的阪崎腸桿菌分離株都具有感染新生兒的能力，然而爆發(fā)來源尚未確定。此外，Guo等[13]也通過利用SNP分析對源自乳品的32株C.sakazakii ST 13菌株進行了分型研究，結果表明，SNP聚簇與原產地及乳制品產品類型之間未呈現(xiàn)有明顯的相關性。雖然SNP分析方法具有高度歧視性，但對參考菌株選取較為敏感，即選取不同參考菌株，SNP分型結果存在差異較大[29]。同時SNP分析是計算密集型的，因此分析流程較長;對于分析大型序列集，必須用高性能計算機進行分析。此外，應用該方法進行分析需要大量的生物信息學知識?；赪GS的擴展的多位點序列分型方法[30]相較于SNP分析則具備諸多優(yōu)勢，如其具有穩(wěn)定的菌株命名法和完善的數(shù)據(jù)庫，能夠實現(xiàn)國際標準化和可擴展性，分析速度快、計算要求復雜度低且無需生物信息專業(yè)知識。因而本實驗并未采用SNP分型技術繼續(xù)對相同ST菌株進行溯源分析，而是選用了基于全基因組測序的擴展的MLST方法對C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫中240株已完成全基因組測序的菌株進行了分型研究。

本研究中所采用的基于全基因組測序的擴展的MLST方法最初是由Forsythe等[9]人建立的cogMLST分析方案，2014年他們利用這一方法對107株克羅諾桿菌進行了全基因組序列分析，進一步證實了C.sakazakii CC 4克隆譜系的穩(wěn)健性。然而，尚未有報道將該方法應用于相同ST菌株的溯源研究當中。本實驗首次利用cog MLST方法對克羅諾桿菌的主要序列型菌株包括：阪崎克羅諾桿菌ST1（67株），ST 4（95株），ST 13（43株）和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌ST 7（35株）分別進行了全基因組序列分析。結果顯示，該方案可對相同ST內的無關菌株進一步細分，不同聚類與菌株分離國家及來源之間存在一定相關性。

cogMLST分析方法在具有較高流行病學一致性的基礎上，能夠實現(xiàn)國際標準化，分析速度快，對計算要求復雜度低且無需專業(yè)的生物信息知識背景，從而能夠快速應用于疾病爆發(fā)過程中克羅諾桿菌屬菌株的精準溯源分析及高效監(jiān)管防控當中。此外，通過采用cogMLST方法對克羅諾桿菌的主要序列型菌株的成功細分表明，過去基于單個或多個基因的分型方法由于納入分析的信息有限，的確誤將許多無關菌株劃分到了一起。同時，通過結果當中所揭示的不同聚類與菌株分離國家及來源之間的密切相關性，能夠進一步表明cogMLST方法對于克羅諾桿菌的溯源分析將是極為有效的分型方法之一。最后，隨著越來越多克羅諾桿菌屬菌株全基因測序數(shù)據(jù)的公開，選取有效的全基因組序列分析方法對于相同ST菌株的全球溯源分析及食源性疾病監(jiān)測至關重要。