孟新濤，魏 健，許銘強(qiáng)，李德華，譚 歸，朱麗娜，邵文志，潘 儼

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所， 烏魯木齊 830091；2.新疆主要農(nóng)副產(chǎn)品精深加工工程技術(shù)研究中心，烏魯木齊 830091 3.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844006；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】石榴(PunicagranatumL.)屬石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益、觀賞價(jià)值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]及醫(yī)用保健功能[3]。新疆石榴主要分布在喀什、和田、阿克蘇及克孜勒蘇州等地區(qū)，主要品種有皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴等[4-5]，占石榴果實(shí)總重量的11%～21%的石榴皮，在生產(chǎn)中食用與加工時(shí)被丟棄，造成嚴(yán)重的浪費(fèi)[2]。目前，我區(qū)石榴深加工企業(yè)較少，分析不同品種石榴果皮中類黃酮物質(zhì)的組分及含量，對(duì)新疆石榴類黃酮物質(zhì)的良種選育和綜合開發(fā)利用有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類黃酮是黃酮類化合物的簡(jiǎn)稱，是一類三元環(huán)色素的總稱[6-7]，是人類膳食攝入不可缺少的組成部分[8-10]，對(duì)人體有多種生理功能且不良反應(yīng)少，是一類安全可靠、成本低、來源廣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有較大的開發(fā)和應(yīng)用前景[11，12]。研究表明，石榴中富含類黃酮物質(zhì)，其果實(shí)提取物對(duì)心腦血管疾病、細(xì)菌感染等具有顯著的防治作用[13-14]。測(cè)定分析方法主要包括分光光度法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[15-18]。高效液相色譜法(HPLC)作為一種簡(jiǎn)單、高效、快速的檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用[15-18]。目前，黃酮類成分的含量測(cè)定方法多以蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、異鼠李素為測(cè)定對(duì)象，但用槲皮素、山奈酚、異鼠李素中其中一種的量換算成總黃酮的量并不能準(zhǔn)確反應(yīng)提取物總黃酮的含量；因此建立石榴皮提取物中5種黃酮類成分(蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素)的同時(shí)測(cè)定方法具有重要意義[18]。【本研究切入點(diǎn)】國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于石榴中的類黃酮研究開展較早，但研究主要集中在石榴汁、石榴花、石榴葉等類黃酮物質(zhì)的定性分析和總量測(cè)定等方面，且大多局限于某一單一品種研究。研究新疆石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的測(cè)定方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以4個(gè)不同石榴品種為試材，采用高效液相色譜法(HPLC)提取和測(cè)定，石榴果皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素)的含量比較分析4個(gè)不同品種石榴果皮中類黃酮物質(zhì)的組分及含量差異，為新疆石榴類黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用和良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

千籽紅石榴采集于新疆喀什市；皮亞曼石榴、賽檸檬石榴采集于新疆和田市皮山縣；葉城石榴采集于喀什市葉城縣；采集時(shí)間均為2015年10月；蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、異鼠李素(純度≥98%)所有標(biāo)準(zhǔn)品為HPLC級(jí)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；D101大孔吸附樹脂，安徽省蚌埠市遼源新材料有限公司；甲醇(色譜純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲酸(色譜純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純；氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCL)，四川西隴化工有限公司。

Anglient HPLC 1260高效液相色譜儀，配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和EZChrom Elite工作站美國(guó)安捷倫公司；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國(guó)Scilogex公司；DZG-303A“艾柯”實(shí)驗(yàn)室專用超純水儀 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；eppendorf 5810R冷凍型臺(tái)式大容量高速離心機(jī) 德國(guó)eppendorf；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；SK7200H型超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確秤取蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素各5 mg；分別加入甲醇溶液溶解后定容到10 mL容量瓶，得到濃度分別為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。檢測(cè)限與定量限按照《中華人民共和國(guó)藥典》確定5種對(duì)照品的檢測(cè)限與定量限[22]。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.002 5、0.006、0.015 和0.02 mg/mL，槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001 、0.005、0.01、0.015、0.02和0.025 mg/mL，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003 、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003 、0.004 、0.008、0.012和0.016 mg/mL，每次吸樣量為20 μL，經(jīng)過高效液相色譜檢測(cè)。以峰面積為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品前處理

石榴皮粉末的制備[3]：將石榴樣品洗凈后取皮，剔除褐變及腐爛部分果皮，置于40 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，用研磨機(jī)粉碎，過100目篩，置于干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

黃酮類化合物的提取[3]：稱取石榴皮粉末1.00 g，置于250 mL錐形瓶中，加入24 mL87%乙醇，59 ℃超聲26 min，抽濾，再用24 mL95%乙醇溶解濾渣，超聲26 min，合并濾液。30 ℃減壓回收溶劑至近干，加10 mL 30%乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，收集樣品用30%乙醇定容至50 mL容量瓶中。吸取1 mL于25 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，搖勻備用。

樹脂的預(yù)處理[1]：將D101大孔樹脂中的破碎樹脂剔除，用蒸餾水浸泡洗去雜物，乙醇浸泡48 h使其溶脹，再用蒸餾水洗至無醇味。在內(nèi)徑10 mm，高300 mm的玻璃層析柱中濕法裝柱后，用4% HCl溶液以3～5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2 h，而后用去離子水以同樣流速洗至出水pH為中性；再用4% NaOH溶液，以3～5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2 h，而后用去離子水以同樣流速洗至出水pH中性。備用。

1.2.3 樣品溶液純化

利用D101大孔吸附樹脂，在溫度30 ℃、吸附料液比1:4(g/mL)、pH為4、洗脫液體積為90%的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用30 mL乙醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液定容至50 mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HPLC色譜條件

色譜柱：C18柱(Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，250 mm× 4.6 mm，孔徑4 μm；)；流動(dòng)相：100%甲醇: 0.2%甲酸=55: 45，流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣；流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃，；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

研究表明,5種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品流出順序分別為蘆丁(保留時(shí)間為6.95 min)，槲皮苷(保留時(shí)間為8.25 min)，槲皮素(保留時(shí)間為12.12 min)，山奈酚(保留時(shí)間為18.20 min)，異鼠李素(保留時(shí)間為21.1 min)。圖1

圖1 對(duì)照品中5種類黃酮色譜圖

Fig.1 HPLC chromatograms of 5flavonoids in standard products

2.2 線性范圍、檢出限、定量限

研究表明,蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚對(duì)照品的檢測(cè)濃度在對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)與峰面積積峰值成良好的線性關(guān)系。

蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素定量限(信噪比10∶1)分別為 0.325、0.504、0.364、0.552及 0.447 μg/mL，檢測(cè)限(信噪比 3∶1)分別為0.134、0.152、0.165、0.226及0.207 μg/mL。表1

表1 5種類黃酮的線性關(guān)系Table.1 Linearity determination of the flavonoids

組分Component回歸方程RegressionequationR2線性范圍(μg/mL)蘆丁RutinY=2.83870×10-9X-0.0001516430.99191^20槲皮苷QuercitrinY=3.313960×10-9X-0.0001416780.99911^16槲皮素QuercetinY=2.127470×10-9X+0.0003521180.99911^30山奈酚ShanafelY=1.310520×10-9X+0.0002207290.99941^16異鼠李素HeterodermLisuY=2.404460×10-9X+0.0001217310.99971^16

注:回歸方程中X代表峰面積,Y代表質(zhì)量濃度。

2.3 回收率

準(zhǔn)確稱取5種類黃酮含量已知的皮亞曼石榴皮粉末、賽檸檬石榴皮粉末、千籽紅石榴皮粉末和葉城石榴皮粉末各6份，分別向其中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按1.2.4的色譜條件進(jìn)樣20 μL，根據(jù)測(cè)定結(jié)果中5種單體黃酮的含量計(jì)算相應(yīng)的回收率。表2

表 2 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n = 6)

Table 2 experiment results of recovery (n = 6)

化合物Compound樣品量SampleQuantity(mg/100g)添加量Addition(mg/100g)測(cè)得量Measuredamount(mg/100g)平均回收率Averagerecoveryrate(%)皮亞曼石榴皮PiyamanPomegranateskin蘆丁14.737.54888.8槲皮苷160.2294532.5126.6槲皮素2.32023103.5山奈酚1.3201778.5異鼠李素0.52018.591.13賽檸檬石榴皮SainingmengPomegranateskin蘆丁13.237.547.591.4槲皮苷129.5294439105.2槲皮素1.92023.5108山奈酚12026124.47異鼠李素02022108.27千籽紅石榴皮QianzihongPomegranateskin蘆丁7.537.541.590.6槲皮苷127.7294468115.7槲皮素1.52022.5105.98山奈酚1201884.41異鼠李素02021.5105.87葉城石榴皮YechenPomegranateskin蘆丁14.837.54888.5槲皮苷79.5294408111.7槲皮素3.52024.5103.60山奈酚2.5201982.80異鼠李素22021.597.40

2.4 精密度

在對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證的過程中，分別對(duì)皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴4個(gè)石榴品種類黃酮提取物進(jìn)行了測(cè)試，按照1.4.1色譜條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算不同進(jìn)樣次數(shù)對(duì)應(yīng)的峰面積，得不同品種石榴皮類黃酮提取物對(duì)應(yīng)的RSD平均值。蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素分別對(duì)應(yīng)的RSD為1.25%，1.19%，1.80%，0.82%，0.19%。該方法精密度良好，可以滿足石榴皮類黃酮檢測(cè)要求。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴石榴皮各1.000 g，平行制備6份樣品溶液，按照HPLC色譜條件，進(jìn)樣20 μL，按照HPLC色譜條件，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算每一份蘆丁對(duì)應(yīng)的峰面積，得平均RSD均小于2%，該方法重復(fù)性良好。表3

表3 重復(fù)性(n=6)

Table 3 Reproducibility test (n=6)

實(shí)驗(yàn)號(hào)Nomber葉城酸石榴蘆丁含量RutincontentofYechen(mg/100g)皮亞曼石榴蘆丁含量RutincontentofPiyaman(mg/100g)賽檸檬石榴蘆丁含量RutincontentofSainingmeng(mg/100g)千籽紅石榴蘆丁含量RutincontentofQianzihong(mg/100g)10.226670.32196440.27109580.19166320.22674980.32740670.26348150.194831330.22245350.32757350.2679950.192947340.23070050.33263540.27653630.191272750.22550120.32429540.27373130.190705460.22587020.32567630.27461720.1927679平均值0.22632420.3265920.27124290.1923646SD2.42619E-053.30851E-054.40469E-051.3555E-05RSD0.010719990.0101304010.0162389290.007046499

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取皮亞曼石榴皮樣品，按照樣品溶液制備方法制備進(jìn)樣溶液，在2.1.5色譜條件下，分別于1、3、5、7、9、11h進(jìn)樣，測(cè)定樣品溶液中的5種類黃酮物質(zhì)中槲皮苷的含量，計(jì)算RSD值均小于2%。表明供試品溶液在11 h內(nèi)穩(wěn)定，該方法穩(wěn)定性良好。

2.7 不同品種石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)測(cè)

研究表明,4個(gè)石榴品種果皮中均檢測(cè)到蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮組分，且槲皮苷和蘆丁是石榴皮5種類黃酮中的主體成分：葉城石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占13.8%和76.7%，合計(jì)90.5%。皮亞曼石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占8.1%和89.2%，合計(jì)97.3%。賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占9.08%和88%，合計(jì)97.08%。千籽紅石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占5.5%和91.6%，合計(jì)97.1%。槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量較低。圖2

圖2 石榴皮提取物中5種類黃酮色譜圖

Fig.2 HPLC chromatograms of 5flavonoids in pomegranate leather extracts

皮亞曼石榴皮中槲皮苷含量是葉城石榴皮的1.84倍，賽檸檬和千籽紅石榴皮中槲皮苷含量低于皮亞曼，且高于葉城石榴皮1.5倍，4個(gè)品種中千籽紅石榴皮蘆丁含量低于其他品種。不同品種石榴皮提取物中蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚總含量由高到低為：皮亞曼石榴皮>賽檸檬石榴皮>千籽紅石榴皮>葉城石榴皮。表4

表4 不同品種石榴果皮中5種類黃酮物質(zhì)含量(n=3)

Table 4 Contents of five flavonoids in peels of pomegranate (n=3) (mg/100 g)

類黃酮物質(zhì)Flavonoids蘆丁Rutin槲皮苷Quercitrin槲皮素Quercetin山奈酚Shanafel異鼠李素HeterodermLisu總和Sum葉城Yecheng15.8±0.587.8±0.84.6±0.43.3±0.12.9±0.6114.5±0.6皮亞曼Piyaman14.7±0.7162.2±0.32.6±0.21.3±0.20.7±0.4181.7±0.3賽檸檬Sainingmeng13.6±0.2131.7±0.82.4±0.51.2±0.60.6±0.8149.7±0.2千籽紅Qianzihong7.9±0.6131.7±0.82.2±0.11.1±0.70.6±0.5143.8±0.4

3 討 論

類黃酮物質(zhì)是石榴中重要功能性物質(zhì)之一，是評(píng)價(jià)石榴果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)[23-24]。de Pascual-Teresa[10]等從石榴果皮中檢測(cè)出4種黃烷醇。朱峰[8]等從泰山紅、大青皮、墨石榴和三白4個(gè)石榴品種果皮中檢測(cè)到楊梅酮、槲皮素、木犀草素、山奈素、芹菜素5種類黃酮物質(zhì)。試驗(yàn)采用HPLC在4個(gè)石榴品種中檢測(cè)到5種類黃酮組分物質(zhì)，分別為蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素和山奈酚，5種類黃酮含量最高的品種為皮亞曼石榴，總含量為181.7 mg/100 g,其次為賽檸檬石榴，含量為149.7 mg/100 g，千籽紅石榴類黃酮含量為143.8 mg/100 g，葉城石榴類黃酮含量較低，為114.5 mg/100 g。研究與上述報(bào)道有差別，原因可能與不同品種有關(guān)，此外可能還與生長(zhǎng)環(huán)境、貯存條件、成熟程度等多種因素有關(guān)。

研究顯示不同石榴品種類黃酮組分和含量有一定差異性，在皮亞曼石榴果皮中，其類黃酮含量整體較高，是石榴功能食品育種的優(yōu)異資源。另外，在目前的石榴加工產(chǎn)業(yè)中，石榴皮大多數(shù)都被廢棄扔掉，研究顯示石榴皮具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

4 結(jié) 論

建立的高效液相色譜分析方法在21 min內(nèi)完成蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素5種類黃酮的分離，分離度較好。5種類黃酮化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性線性關(guān)系良好，其精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<2%，回收率在76.68%～124.50%范圍類，檢出限為0.2 mg/kg，定量限為5 mg/kg，是一種檢測(cè)分析石榴類黃酮組成和含量的簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的方法。