雷敬超， 周 會， 高麗花， 楊翠芳， 周 珊， 張保青， 王澤平， 楊榮仲， 李 翔， 高軼靜

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室， 南寧 530007)

目前，通過選配甘蔗親本進行授粉雜交仍是甘蔗育種的主要方式，而甘蔗亞硫酸法養(yǎng)莖雜交是保證在一定時間內(nèi)蔗莖進行新陳代謝、完成開花結(jié)實的一項重要技術(shù)。該方法節(jié)省大量人力，不浪費花穗，特別是錯過包莖時間的親本，而且便于集中管理，雜交效果好，大大提高了花穗的生產(chǎn)效率。因此，研究該方法養(yǎng)莖雜交過程中穗莖節(jié)數(shù)和溶液更換周期對開花結(jié)實的影響，可為甘蔗亞硫酸法養(yǎng)莖雜交中開花親本的保存、生長提供參考依據(jù)。甘蔗亞硫酸養(yǎng)莖雜交法最早由美國的Verret等[1]提出，然后經(jīng)由各國甘蔗育種工作者不斷改進并利用。在我國，最早由海南甘蔗育種場的陳西文[2]對亞硫酸法的水質(zhì)、配方、雜交期間的溫度和濕度進行了研究，之后，云南農(nóng)科院甘蔗所的王麗萍[3]對傳統(tǒng)的高壓包莖法和亞硫酸養(yǎng)莖法進行了比較，陳玉水等[4-5]在描述臺灣糖業(yè)研究所對甘蔗種子發(fā)芽力影響因素的研究中，也應(yīng)用高壓包莖法和亞硫酸養(yǎng)莖法進行了比較。研究結(jié)果均表明，甘蔗亞硫酸養(yǎng)莖雜交能提高種子的飽滿度和有效花穗率，值得進一步研究利用。甘蔗亞硫酸法作為甘蔗開花雜交的一項重要技術(shù)，除了配方的改良、雜交期間的溫度和濕度外，對該方法的其它影響因素研究未見相關(guān)報道。因此，本研究選取2個易開花的優(yōu)良親本作為試驗材料，試驗地點設(shè)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心海南甘蔗雜交基地，設(shè)置不同的穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期，對各處理的自交發(fā)芽率進行統(tǒng)計分析。確定最佳的穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液更換周期，以期在甘蔗選育種的雜交過程中應(yīng)用亞硫酸法為開花親本的保存、生長提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的2份甘蔗親本為易開花的優(yōu)良親本桂糖44號和云野06-9。其中桂糖44號(桂糖的英文代碼用GT表示)為廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所選育，桂糖系列品種均具有早熟、高糖、豐產(chǎn)、宿根性好的特點[6-8]；云野06-9是割手密BC4材料(云野的英文代碼用YunY表示)，主要具有早熟的特點，為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所惠贈。試驗地點設(shè)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心海南甘蔗雜交基地，砍取甘蔗穗莖的時間為2018年11月23日。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計

2個開花親本的穗莖節(jié)數(shù)分別選取15節(jié)、20節(jié)、25節(jié)(穗莖節(jié)數(shù)從花穗下第1片葉開始計算，第15葉位對應(yīng)的節(jié)定義為第15節(jié))，各設(shè)置3 d、5 d、7 d的亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期，每個處理3次重復(fù)。每個處理分別置于亞硫酸溶液中養(yǎng)莖自交，40 d后對收集各處理的種子進行發(fā)芽試驗，統(tǒng)計各處理的克平均發(fā)芽數(shù)。

1.2.2抽穗率調(diào)查

記錄供試親本的開花株數(shù)和總有效株數(shù)，統(tǒng)計供試親本抽穗率，抽穗率(%)=(抽穗株數(shù)/總株數(shù))×100%。

1.2.3花粉染色率測定

花粉染色率的測定采用碘-碘化鉀染色法[8]。在顯微鏡下觀察視野中，呈球形且被染成藍褐色的花粉粒為可能具有活性的花粉，而呈三角形或皺縮且未被染色或染色很淺的花粉粒則為未發(fā)育或發(fā)育不全的無活性花粉。花粉量和染色率采用3位數(shù)數(shù)值表示方法，該方法從澳大利亞甘蔗產(chǎn)業(yè)研究所(SugarResearchAustralia，SRA)引進：估算觀察視野中花粉量占總視野面積的比例，比例低于50%時百位數(shù)用1表示，超過50%時百位數(shù)用2表示；十位和個位數(shù)表示花粉染色率。染色率(%)=(視野中被染色的花粉粒數(shù)/視野中總花粉粒數(shù))×100%。

1.2.4亞硫酸法養(yǎng)莖雜交

選擇開花長勢一致的抽穗莖，從根部截斷，剪除大部分葉片，運回溫室，按試驗設(shè)計的節(jié)數(shù)，快速切去穗莖下端節(jié)間組織，迅速插入盛有18 L亞硫酸溶液的桶中。每日08：00時和10：00時進行人工授粉，搖動花穗，使花粉飄落至花穗上，人工授粉過程持續(xù)7 d。雜交溫室內(nèi)控制溫度在25～28 ℃，相對濕度在60%～85%。亞硫酸養(yǎng)莖溶液配方為每升水溶液含：亞硫酸(以SO2計)154.5 mg，硫酸39.1 mg，硝酸54.6 mg，磷酸89.8 mg。

1.2.5發(fā)芽試驗

雜交完畢15 d左右，用特制沙袋套住整個花穗，下端扎緊；35 d后，剪下花穗，放入烘干房間(溫度11 ℃，濕度13%)進行干燥處理4 d，然后脫粒，裝入防水紙袋中。稱取約0.5 g，每個處理3次重復(fù)，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，平鋪種子，噴水，濕潤種子和濾紙，再放置于光照培養(yǎng)箱(32 ℃，12 h暗期，12 h光照)中培養(yǎng)5 d，然后統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)量?？似骄l(fā)芽數(shù)=種子發(fā)芽數(shù)/種子重量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用R語言ggplot 2軟件包進行差異顯著性分析，應(yīng)用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗親本的開花習(xí)性

桂糖44號和云野06-9的抽穗率分別為40%和50%，均屬易開花親本，可為該試驗設(shè)計的多個處理提供足夠的穗莖(表1)。桂糖44號和云野06-9的花粉量和花粉染色率均為255%，說明該2個親本花粉量中等(百位數(shù)為2)，染色率約為55%，保證了供試材料進行自交的花粉量和花粉活性(表1，圖1，圖2)。

表1 甘蔗親本的開花習(xí)性

親本抽穗率/%花粉量及平均染色率/%開花特點桂糖44號40255先抽后開云野06-950255邊抽邊開

注：用3位數(shù)數(shù)值組合來表示花粉量和染色率，百位數(shù)代表花粉量，1表示少，2表示多；十位和個位數(shù)以百分數(shù)形式表示染色率。

圖1 桂糖44號花粉鏡檢觀察

圖2 云野06-9花粉鏡檢觀察

2.2 穗莖節(jié)數(shù)和溶液更換周期對亞硫酸法養(yǎng)莖雜交的影響

差異顯著性分析表明，穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期對親本開花結(jié)實的影響沒有顯著差異。在本試驗中，穗莖節(jié)數(shù)為15節(jié)時，2個親本的克平均發(fā)芽數(shù)均隨著亞硫酸溶液更換周期天數(shù)的增加而增加，并且在更換周期為7 d時的克平均發(fā)芽數(shù)為所有組合處理中最高；穗莖節(jié)數(shù)為20節(jié)時，桂糖44號在各個亞硫酸溶液更換周期組合處理中的克平均發(fā)芽數(shù)無明顯差異，云野06-9在亞硫酸溶液更換周期為5 d的組合處理中克平均發(fā)芽數(shù)最低；穗莖節(jié)數(shù)為25節(jié)時，桂糖44號在亞硫酸溶液更換周期為5 d的組合處理中克平均發(fā)芽數(shù)最低，云野06-9在各個亞硫酸溶液更換周期組合處理中的克平均發(fā)芽數(shù)無明顯差異(圖3)。

圖3 穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液更換周期對 親本養(yǎng)莖雜交的影響

3 討 論

本研究選擇的2個親本花粉量和染色率都較高，然而自交后的克平均發(fā)芽數(shù)都較低(不超過30)，這與前人所述的甘蔗自交結(jié)實率很低[9]的結(jié)果一致，但是整體偏低的發(fā)芽數(shù)數(shù)據(jù)導(dǎo)致各處理間的差異幅度不能更大程度地顯現(xiàn)。在后續(xù)的甘蔗亞硫酸法養(yǎng)莖雜交影響因素試驗中，可考慮用供試親本作為父本與同一個母本雜交，提高結(jié)實率。

亞硫酸溶液養(yǎng)莖雜交的原理是亞硫酸溶液中的二氧化硫作為防腐劑，不僅可抑制微生物的生長，還具有還原作用，可防止主體被氧化。本研究的亞硫酸溶液更換周期從3 d至7 d均未對親本的開花結(jié)實具有顯著影響，說明在本試驗條件下(溫度25～28 ℃，濕度60%～85%)，即使亞硫酸溶液中的二氧化硫有所揮發(fā)，但其初始濃度(154.5 mg·L-1)足夠維持親本在7 d內(nèi)的生長。

本研究結(jié)果顯示，穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期對親本開花結(jié)實的影響沒有顯著差異，并且穗莖節(jié)數(shù)為15節(jié)、亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期為7 d的組合處理的發(fā)芽效果最好，說明不僅在砍取穗莖時可選擇較短的長度(15節(jié))，為穗莖的運輸帶來便利，并且在養(yǎng)莖雜交過程中也不需要頻繁更換溶液，節(jié)約了人工和成本。

4 結(jié) 論

穗莖節(jié)數(shù)和亞硫酸溶液養(yǎng)莖更換周期對親本開花結(jié)實的影響沒有顯著差異，在砍取穗莖時可選擇較短的長度，在養(yǎng)莖雜交過程中也不需要頻繁更換溶液，節(jié)約了人工和成本。