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MTA及iRoot BP Plus對人牙髓干細(xì)胞增殖活性的影響

2019-11-06 15:12俞琪鄧淑麗
中國保健營養(yǎng) 2019年11期

俞琪 鄧淑麗

【摘 ?要】 目的:研究并比較MTA及iRoot BP Plus對人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖活性的影響。方法:將MTA及iRoot BP Plus制備成濃度稀釋比例為0、0.001、0.01、0.1、0.2、1的條件浸取液,檢測培養(yǎng)1、3、7天時(shí)細(xì)胞的增殖活性及3、7天時(shí)的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)表達(dá)量。結(jié)果:使用不同濃度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培養(yǎng)hDPSCs時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞數(shù)量顯著增多(p <0.05)。但高濃度(稀釋比例為1)MTA浸取液存在明顯的細(xì)胞毒性作用。在相同培養(yǎng)時(shí)間下,iRoot BP Plus比相同稀釋比例的MTA更能促進(jìn)hDPSCs的增殖且高濃度培養(yǎng)無細(xì)胞毒性。使用不同濃度的MTA及iRoot BP Plus浸取液培養(yǎng)hDPSCs時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,AKP表達(dá)量顯著增高(p <0.05)。但在高濃度iRoot BP Plus組中,hDPSCs的AKP表達(dá)量隨時(shí)間明顯下降。在相同濃度下,iRoot BP Plus組的第3天AKP表達(dá)量普遍高于MTA組;但低濃度(稀釋比例0.001)AKP表達(dá)量低于MTA組(p <0.05)。在低濃度下(比例為0.001及0.01),iRoot BP Plus組第7天的AKP表達(dá)量普遍高于MTA組(p <0.05);但高濃度(比例為0.1、0.2和1)的AKP水平低于MTA組(p <0.05)。結(jié)論: MTA對hDPSCs的促礦化能力較強(qiáng),但高濃度下存在一定的細(xì)胞毒性作用。iRoot BP Plus相較MTA具有更好的生物相容性,不會(huì)抑制hDPSCs增殖分化。但兩者均對細(xì)胞的AKP表達(dá)量具有一定的抑制作用,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,高濃度時(shí)iRoot BP Plus的抑制作用更為顯著。

【關(guān)鍵詞】牙髓干細(xì)胞;MTA;iRoot BP Plus;堿性磷酸酶;細(xì)胞活性

【中圖分類號】R181.3+2 ??【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A???【文章編號】1004-7484(2019)10-0184-03

牙髓干細(xì)胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)是位于牙髓內(nèi)的成體干細(xì)胞,由神經(jīng)嵴發(fā)育而來[1,2]。DPSCs廣泛存在于成熟及年輕恒牙根尖底部,可以定植在根管壁上,進(jìn)而分化為成骨細(xì)胞,能形成牙本質(zhì)- 牙髓樣結(jié)構(gòu),在牙髓再生術(shù)中發(fā)揮著重要作用[3,4]。

生物陶瓷材料MTA(Mineral Trioxide Aggregate)及iRoot BP plus作為新興的髓腔修補(bǔ)及蓋髓材料,相較傳統(tǒng)修復(fù)材料具有更好的生物相容性、穩(wěn)定性、抗菌性和細(xì)胞安全性。MTA可誘導(dǎo)細(xì)胞成骨、硬組織形成[5-7],但同時(shí)也存在著操作不便、著色等問題[8]。iRoot BP plus相較MTA具備更好的生物相容性和促進(jìn)牙本質(zhì)形成鈣化橋的能力[8,9],且無著色問題。

本實(shí)驗(yàn)擬探討iRoot BP Plus相較MTA對hDPSC的增殖及促成骨能力的影響,以期為臨床決策作一定的參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料 PROROOT MTA (Dentsply,美國),iRoot BP Plus (Innovative Bioceramic Inc. 加拿大);CCK-8試劑盒(BestBio,中國),堿性磷酸酶測試盒(南京建成生物)

1.1 ?DPSCs的分離、提純和鑒定 選取在浙江大學(xué)附屬口腔醫(yī)院12~24歲的患者,因正畸或阻生拔除的完整恒牙(無牙周及牙體疾?。0纬昂笱例X表面充分消毒,置入4℃含青霉素及鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)中轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行取樣(所有操作均經(jīng)患者及其監(jiān)護(hù)人同意)。分離牙冠后用改良組織塊酶消化法[10]行原代培養(yǎng),培養(yǎng)至P3代備用,并進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo)能力的鑒定。

1.2 材料浸取液的制備 MTA及iRoot BP Plus調(diào)拌后37℃硬化48h后取出,5ml 含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液浸取培養(yǎng)48h后過濾,制備成不稀釋、1:5、1:10、1:100及1:1000比例稀釋的條件浸取液備用。

1.3 ?CCK-8測定不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs細(xì)胞增殖活性的影響 取生長良好的P3代hDPSCs,充分消化計(jì)數(shù)后以每孔50個(gè)細(xì)胞接種,培養(yǎng)24h后換成上述不同稀釋比例的MTA及iRoot BP的浸取培養(yǎng)液。10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液作陰性對照,隔天換液。分別在培養(yǎng)1d、3d、7d時(shí)用酶標(biāo)儀于450nm處測量吸光值。

1.4 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs堿性磷酸酶表達(dá)量的影響 ?取生長良好的P3代hDPSCs,充分消化計(jì)數(shù)后以105 /ml接種,培養(yǎng)24h后更換不同濃度的MTA及iRoot BP培養(yǎng)基。10% α-MEM培養(yǎng)液作對照,隔天換液。分別在培養(yǎng)3d、7d時(shí)酶標(biāo)儀于520nm處測量吸光值,562nm處測定蛋白含量,校準(zhǔn)AKP測定值誤差。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所測數(shù)據(jù)用SPSS 24.0(IBM) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果用±s表示,計(jì)數(shù)資料使用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。使用Graphpad Prism 5 繪制統(tǒng)計(jì)圖。p <0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs細(xì)胞增殖活性的影響

不同濃度的MTA及iRoot BP Plus條件浸取液培養(yǎng)hDPSCs,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,細(xì)胞數(shù)量顯著增高(p <0.05)。未經(jīng)稀釋的MTA浸取液(比例為1)在培養(yǎng)7天后對細(xì)胞活性存在明顯的抑制作用(p <0.05)(圖1.1A)。不同培養(yǎng)時(shí)間,iRoot BP Plus對細(xì)胞增殖活性的影響存在一濃度依賴的正態(tài)分布曲線,且當(dāng)比例為0.1~0.2時(shí)對hDPSCs的促進(jìn)作用最強(qiáng)(圖1.1B)。

在相同培養(yǎng)時(shí)間下,iRoot BP Plus比相同比例的MTA更能促進(jìn)hDPSCs的增殖,且長時(shí)間培養(yǎng)時(shí),在高濃度區(qū)段(稀釋比例為0.1/0.2/1)未產(chǎn)生細(xì)胞抑制(p<0.05)(圖1.2)

2.2 不同濃度MTA及iRoot BP Plus對hDPSCs堿性磷酸酶表達(dá)量的影響 ?不同濃度的MTA及iRoot BP Plus條件浸取液處理hDPSCs,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,AKP表達(dá)量顯著升高(p<0.05)(圖2.1)。

培養(yǎng)3天后,稀釋比例為0.001的MTA組AKP表達(dá)量高于對照組,其余組低于對照組(p<0.05),且隨著濃度的增加,表達(dá)量越低;iRoot BP Plus組不同濃度浸取液對hDPSCs的AKP表達(dá)量影響較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2.2A)。培養(yǎng)7天后,MTA組稀釋比例為0.001及1時(shí), AKP表達(dá)量顯著低于對照組(p <0.05),其余組較對照組無差異(圖2.2B);iRoot BP Plus組的AKP表達(dá)量較對照組顯著下降(p<0.05)且在高濃度區(qū)段(0.1/0.2/1),隨著濃度的增加,AKP表達(dá)量越少。但比例為0.01的處理組, hDPSCs的AKP表達(dá)隨時(shí)間增加(p<0.05)。

相同稀釋比例的浸取液培養(yǎng)hDPSCs,培養(yǎng)3天時(shí),iRoot BP Plus組AKP表達(dá)量普遍高于MTA組,但稀釋比例為0.001時(shí),表達(dá)量低于MTA組(p<0.05)(圖2.2A)。培養(yǎng)7天后,低濃度(0.001/0.01)的iRoot BP Plus組AKP表達(dá)量普遍高于MTA組,僅0.01組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;高濃度(0.1/0.2/1),表達(dá)量較低(圖2.2B)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,相同稀釋比例的iRoot BP Plus比MTA更能促進(jìn)細(xì)胞增殖,且高濃度時(shí)未出現(xiàn)細(xì)胞抑制。該結(jié)果表明iRoot BP Plus不會(huì)抑制細(xì)胞生長或增殖,且其生物相容性優(yōu)于MTA。類似研究[12]將hDPSCs分別接種于MTA、iRoot BP Plus上,MTA存在明顯的細(xì)胞毒性,而iRoot BP Plus在培養(yǎng)早期顯著增加細(xì)胞活性,但隨著培養(yǎng)時(shí)間增長,其細(xì)胞增殖活性下降。Zhang[13]等比較了MTA和iRoot BP Plus的體內(nèi)外生物學(xué)活性,發(fā)現(xiàn)iRoot BP Plus相較MTA能組裝更多羥基磷灰石,且可濃度依賴性促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的黏附及遷移,牙本質(zhì)橋形成及牙源性蛋白(DSP/DMP1)及黏附相關(guān)分子(Vincullin/p-Paxillin)的表達(dá)。而Samyuktha[14]等的研究卻發(fā)現(xiàn)iRoot BP 處理人成骨細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞后,細(xì)胞毒性高于MTA。 MTA內(nèi)含三氧化二鉍,對細(xì)胞毒性影響較大[15]。其機(jī)制在于鉍類化合物可直接作用DNA,下調(diào)Bcl-2等蛋白表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。iRoot BP Plus用氧化鉭及氧化鋯代替三氧化二鉍,因此無細(xì)胞毒性。

AKP參與硬組織的礦化和形成,是檢測細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)之一[17]。本實(shí)驗(yàn)中,低濃度(稀釋比例為0.001~0.1)的MTA及iRoot BP Plus均能促進(jìn)hDPSCs的AKP表達(dá),表明iRoot BP Plus和MTA均有一定的促礦化作用。有研究表明[18,19],MTA可通過NF-κB、ERK/p38通路誘導(dǎo)根尖牙乳頭干細(xì)胞成牙及成骨分化。培養(yǎng)7天后,MTA及iRoot BP Plus中多組濃度的AKP表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降。這可能與細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)。鏡下觀察到細(xì)胞呈堆疊狀生長,無法有效接觸培養(yǎng)液,因此影響了生長代謝。加上高濃度MTA的細(xì)胞毒性作用,細(xì)胞數(shù)量明顯下降,AKP代謝減少。高濃度MTA組的AKP表達(dá)量高于iRoot BP Plus組可能因?yàn)楦邼舛萯Root BP Plus雖會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖,但也會(huì)抑制胞內(nèi)AKP代謝,這與一些研究結(jié)果類似。Dedeus G[20]等研究推測iRoot BP對細(xì)胞代謝水平的影響高于其對細(xì)胞密度層面的影響。Modareszadeh M R[21]等發(fā)現(xiàn)在不同培養(yǎng)時(shí)間下,iRoot BP Plus顯著降低細(xì)胞AKP水平。

材料塊及條件浸取液的制備過程可能是導(dǎo)致不同研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在偏差的原因。Hakki[22]利用MTA的上清液研究其對成牙骨質(zhì)細(xì)胞的作用,這一方法使得材料的濃度得以量化。而iRoot BP Plus作為預(yù)調(diào)膏劑可直接使用,兩者雖浸取比例相同,但其真實(shí)濃度無法完全一致。在濕潤環(huán)境下,iRoot BP Plus其內(nèi)的硅酸鈣可以水解生成硅酸鈣水合物凝膠及氫氧化鈣,后者與磷酸鹽反應(yīng)生成羥基磷灰石和水,水又可繼續(xù)參與反應(yīng)[23]。相較于根管內(nèi)環(huán)境,本實(shí)驗(yàn)的iRoot BP Plus材料塊固化過程中只有一底面接觸濕潤環(huán)境,其余面濕化不足,材料塊內(nèi)、外表面的固化程度存在差異[24],造成浸取液濃度誤差。另外iRoot BP Plus材料塊在48h后體積膨脹明顯,增加了其浸取表面積/浸取液體積比值,使浸取液濃度增高。Walsh RM[25]等研究結(jié)果證實(shí)了iRoot BP固化過程中的體積膨脹。而MTA固化后因水分蒸發(fā),會(huì)出現(xiàn)一定的體積收縮,浸取表面積減小,使浸取濃度偏低。

4 結(jié)論

MTA對hDPSCs的促礦化能力較強(qiáng),但高濃度下存在一定的細(xì)胞毒性作用。iRoot BP Plus相較MTA具有更好的生物相容性,不會(huì)抑制hDPSCs增殖分化。但兩者均對細(xì)胞的AKP表達(dá)量具有一定的抑制作用,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,高濃度時(shí)iRoot BP Plus的抑制作用更為顯著。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(基金號:2016KYA118)

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