趙夢,汪玉寶，張淳

胃癌是消化道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第二[1]。近年來，胃癌發(fā)病率呈現(xiàn)增長趨勢，我國是胃癌的高發(fā)地區(qū),每年新增發(fā)病人數(shù)約60萬[2]。由于胃癌患者早期無典型癥狀，患者確診時多處于進展期，常伴隨有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]，所以，胃癌患者的治療療效較差，預(yù)后不佳，晚期胃癌患者5年生存率不超過10%[4]。因此，探尋胃癌的發(fā)病機制并尋找胃癌治療的作用靶點具有重要意義。微小RNA(micro RNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，長度約為18～25個核苷酸，可與靶mRNA的3′或5′端UTR區(qū)結(jié)合，抑制mRNA翻譯或降解mRNA，調(diào)控基因的表達[5]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在胃癌中表達異常，參與胃癌細胞的生物學(xué)行為，影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。如miR-27a在胃癌組織和細胞中高表達，并且可能通過激活Wnt /β-catenin信號通路靶向SFRP1促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。miR-103a-3p在胃癌組織中表達升高，其在體外通過靶向抑制ATF7表達促進胃癌細胞的增殖[7]。研究顯示，miR-514a-3p在黑素瘤、人睪丸生殖細胞腫瘤中異常表達，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。但miR-514a-3p在胃癌細胞中的表達及其對胃癌細胞生物學(xué)行為影響和作用機制的相關(guān)研究還未見報道。本研究檢測了胃癌細胞MGc-803和SGC-7901中miR-514a-3p表達水平，并探討了miR-514a-3p對SGC-7901細胞活力、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機制，以期為胃癌的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

胃癌細胞MGc-803和SGC-7901以及正常胃上皮細胞GES-1均購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。胎牛血清(FBS)，杭州四季青；高糖DMEM、MTT和二甲基亞砜，北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑，美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京諾博萊德科技有限公司；PCR試劑盒，日本TOYOBO公司；PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成；與轉(zhuǎn)染相關(guān)miR-514a-3p mimics、陰性對照等，廣州銳博生物科技有限公司； lipofectamineTM2000試劑盒，上海陽光生物科技有限公司；RIPA裂解液、TBST、SDS-PAGE凝膠配制試劑以及BCA蛋白測定試劑盒，上海碧云天公司；脾酪氨酸激酶(Syk)抗體，LabVision公司；GAPDH、Cyclin D1、P21、E-cadherin和MMP-2，美國Santa Cruz；HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，武漢博士德生物工程有限公司；熒光素酶活性檢測試劑盒，上海鈺博生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) GES-1、MGc-803和SGC-7901細胞均采用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況和培養(yǎng)基顏色變化，每2～3天換液一次。待細胞融合至80%左右時，胰酶消化，進行傳代或?qū)嶒?。取適量對數(shù)期各細胞，采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-514a-3p表達水平。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-514a-3p表達 收集各組細胞，PBS清洗后加入Trizol試劑提取總RNA。分光光度計檢測RNA的純度和濃度。當(dāng)RNA溶液在260 nm和280 nm處的吸光值比值處于1.8～2.0時可用于后續(xù)實驗。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，將提取得到的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行擴增。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算細胞中miR-514a-3p的相對表達水平。

1.2.3 細胞分組和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，采用lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染實驗。SGC-7901細胞分為anti-miR-514a-3p組和anti-miR-NC組，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-514a-3p和anti-miR-NC；miR-NC組和miR-514a-3p組，分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-514a-3p mimics；anti-miR-514a-3p+si-NC組和anti-miR-514a-3p+si-Syk組，分別共轉(zhuǎn)染anti-miR-514a-3p與si-NC，anti-miR-514a-3p與si-Syk。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT檢測細胞活力 轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞，調(diào)整濃度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板，吸棄上清液，向每孔中加入150 μL的二甲基亞砜溶液，室溫下反應(yīng)5 min，混合均勻，于酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔的OD值。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 ①細胞遷移實驗：轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細胞，采用無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL。取200 μL細胞懸液，直接加入至Transwell小室的上室中，下室加入500 μL含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出小室，使用棉簽擦掉上室表面細胞，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗3次，置于顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野計數(shù)，取平均值作為遷移細胞數(shù)。②細胞侵襲實驗：首先在小室的上室鋪Matrigel基質(zhì)作為侵襲模型，然后在加入細胞懸液，剩余操作與細胞遷移實驗相同。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 各組SGC-7901細胞置于冰上，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解30 min后，4 ℃、12 000 rpm離心15 min。收集上清液(蛋白)，采用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。取適量蛋白溶液，加入上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。然后行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫條件下進行封閉，封閉時間2 h。加入一抗，置于4 ℃冰箱中進行孵育，時間12 h。TBST洗膜，加入HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，室溫條件孵育1 h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)曝光拍照。Image 軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，Syk的3′UTR含有miR-514a-3p的互補序列，miR-514a-3p可能靶向調(diào)控Syk表達。為了驗證miR-514a-3p對Syk的靶向調(diào)控作用，構(gòu)建Syk野生型(WT)和突變型(MUT)質(zhì)粒。分為WT-Syk組和MUT-Syk組，WT-Syk組插入Syk野生型質(zhì)粒3′UTR片段的熒光素酶報告基因載體，MUT-Syk組插入Syk突變型質(zhì)粒3′UTR片段的熒光素酶報告基因載體。并分別在SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-514a-3p mimics，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-514a-3p在正常胃上皮細胞GES-1和胃癌細胞MGc-803、SGC-7901中的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常胃上皮細胞GES-1比較，胃癌細胞MGc-803和SGC-7901中miR-514a-3p表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明胃癌細胞中miR-514a-3p呈高表達。此外，胃癌細胞SGC-7901中miR-514a-3p表達水平相對于MGc-803較高，因此，后續(xù)實驗選擇SGC-7901細胞作為研究對象。見表1。

表1 miR-514a-3p在細胞GES-1和細胞MGc-803、SGC-7901中的表達

注：與GES-1組比較，*P<0.05

2.2 抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901活力的影響

分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-514a-3p至SGC-7901細胞，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞中miR-514a-3p表達水平顯著降低(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染anti-miR-514a-3p抑制了SGC-7901細胞中miR-514a-3p表達。MTT檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后OD值均顯著降低(P<0.05)，說明抑制miR-514a-3p表達降低了SGC-7901細胞活力。Western blot檢測結(jié)果(圖1)顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞中Cyclin D1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，P21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見表2。

圖1抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901增殖蛋白表達的影響

表2 抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901活力的影響

2.3 抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

Transwell檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，說明抑制miR-514a-3p表達降低了SGC-7901細胞的遷移和侵襲能力。Western Blot檢測結(jié)果(圖2)顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)，MMP-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見表3。

圖2抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲蛋白表達的影響

表3 抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的影響

2.4 miR-514a-3p靶向調(diào)控Syk

生物信息學(xué)軟件顯示，Syk的3′UTR含有miR-514a-3p的互補序列，見圖3A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-514a-3p mimics 對 MUT-Syk組的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)，但能顯著降低WT-Syk組的熒光素酶活性(P<0.05)，見表4。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果(圖3B)顯示，miR-514a-3p組SGC-7901細胞中Syk mRNA和蛋白表達均顯著低于miR-NC組，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞中Syk mRNA和蛋白表達均顯著高于anti-miR-NC組，進一步說明，miR-514a-3p靶向負調(diào)控Syk表達,見表5。

圖3miR-514a-3p靶向、調(diào)控Syk A：Syk的3′UTR含有miR-514a-3p的互補序列；B：miR-514a-3p調(diào)控Syk的表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 miR-514a-3p調(diào)控Syk的表達

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.5 下調(diào)Syk表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲的作用

分別轉(zhuǎn)染anti-miR-514a-3p與si-NC、si-Syk至SGC-7901細胞，Western Blot檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-514a-3p+si-NC組比較，anti-miR-514a-3p+si-Syk組SGC-7901細胞中Syk蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，說明下調(diào)Syk表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對Syk蛋白表達的促進作用。MTT和Transwell檢測結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后OD值均顯著升高(P<0.05)，SGC-7901細胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.05)，說明下調(diào)Syk表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對miR-514a-3p細胞活力、遷移和侵襲的抑制作用。Western blot檢測結(jié)果(圖4)顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-514a-3p組SGC-7901細胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05),見表6、7。

3 討論

胃癌具有較高的發(fā)病率和致死率[10]。隨著醫(yī)學(xué)水平的進步，近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率有所降低，但是患者預(yù)后仍然不理想[11]。多數(shù)胃癌患者的死亡是由于腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[12]。研究表明，miRNA可調(diào)控與細胞增殖、遷移和侵襲等生命過程相關(guān)的基因表達，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。研究胃癌中異常表達的miRNA及其調(diào)控機制，可為胃癌的靶向治療提供新靶標(biāo)。

圖4抑制Syk能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表6 抑制Syk能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901增殖的作用

注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-514a-3p+si-NC組比較，#P<0.05

表7 抑制Syk能逆轉(zhuǎn)抑制miR-514a-3p表達對胃癌細胞SGC-7901遷移、侵襲的作用

注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-514a-3p+si-NC組比較，#P<0.05

miR-514a-3p定位于chrXq27.3，在腎細胞癌[14]等多種腫瘤中表達異常，影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程。有報道稱，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織中miR-514a-3p表達上調(diào)[15]，但miR-514a-3p在胃癌細胞中的表達以及miR-514a-3p表達對胃癌細胞活力、遷移和侵襲的影響還未見報道。本研究首先采用qRT-PCR檢測了胃癌細胞MGc-803和SGC-7901中miR-514a-3p表達水平，結(jié)果顯示，胃癌細胞中miR-514a-3p呈高表達，提示miR-514a-3p可能作為促癌基因參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展。通過siRNA干擾抑制SGC-7901細胞中miR-514a-3p表達，結(jié)果顯示，抑制miR-514a-3p表達降低了SGC-7901細胞的活力、遷移和侵襲能力。Cyclin D1是一種原癌基因，當(dāng)其表達異常升高時會引起細胞增殖失控[16]。P21是一種細胞周期依賴性激酶抑制因子，可抑制細胞增殖[17]。細胞間粘附作用和連接能力的降低，會導(dǎo)致腫瘤細胞脫落并轉(zhuǎn)移到其他組織和器官。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細胞表型向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變的過程，主要表現(xiàn)為細胞粘附分子表達減少等，腫瘤遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密不可分[18]。上皮鈣粘素(E-cadherin)是上皮的分子標(biāo)志物，研究顯示，其表達下調(diào)是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要特征[19]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類可降解細胞外基質(zhì)和基底膜的酶，可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[20]。本研究顯示，抑制miR-514a-3p表達可降低Cyclin D1和MMP-2蛋白表達，促進P21與E-cadherin蛋白表達，提示miR-514a-3p可能通過調(diào)控與細胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達影響胃癌細胞的活力、遷移和侵襲能力。研究顯示，miR-514a-3p在腎細胞癌(RCC)組織和細胞中表達下調(diào)，上調(diào)miR-514a-3p表達可能通過EGFR/MAPK/ERK途徑抑制RCC細胞的增殖、活力、遷移和侵襲，并負向調(diào)節(jié)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達，miR-514a-3p作為抑癌基因參與腎細胞癌發(fā)生和發(fā)展[21]。這與本研究miR-514a-3p在胃癌細胞中高表達結(jié)果不一致，可能與腫瘤類型不同有關(guān)，表明miR-514a-3p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。

MiRNA常與靶mRNA的3′或5′ UTR區(qū)結(jié)合，抑制mRNA翻譯或裂解mRNA，通過調(diào)控靶基因的表達參與腫瘤的發(fā)展進程。為了進一步了解miR-514a-3p影響胃癌細胞生物學(xué)行為的調(diào)控機制，采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Syk的3′UTR含有miR-514a-3p的互補序列，提示miR-514a-3p可能通過調(diào)控Syk表達影響胃癌細胞的活力、遷移和侵襲。本研究雙熒光素酶報告基因結(jié)果證實miR-514a-3p可與Syk的3′UTR結(jié)合。并且上調(diào)miR-514a-3p表達可抑制SGC-7901細胞中Syk mRNA和蛋白表達，而下調(diào)miR-514a-3p表達促進了SGC-7901細胞中Syk mRNA和蛋白表達，進一步說明miR-514a-3p在SGC-7901細胞中靶向負調(diào)控Syk表達。

酪氨酸激酶是一組在信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。Syk是酪氨酸激酶家族中的成員之一，基因定位于染色體9q22，在造血細胞、淋巴細胞、血管內(nèi)內(nèi)皮細胞等細胞廣泛表達。研究顯示，Syk在乳腺癌、喉癌、宮頸癌等多種腫瘤中表達缺失或低表達，參與腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)[22-24]。有報道稱，胃癌組織中Syk陽性表達與患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)，Syk表達缺失增強胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為[25]。還有研究顯示，與Syk陰性表達的胃癌組織細胞相比，Syk陽性表達的胃癌組織細胞凋亡率明顯升高，Syk通過誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡抑制其生長和轉(zhuǎn)移[26]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Syk表達可有效逆轉(zhuǎn)miR-514a-3p表達對胃癌細胞活力、遷移和侵襲的抑制作用，提示miR-514a-3p靶向負調(diào)控Syk表達影響胃癌細胞的生物學(xué)行為，是胃癌治療的潛在靶標(biāo)。

綜上所述，胃癌細胞中miR-514a-3高表達，抑制miR-514a-3表達可有效抑制胃癌細胞的活力、遷移和侵襲能力，其可能通過靶向下調(diào)Syk表達發(fā)揮作用，為胃癌的靶向治療提供了新的作用靶點及一定的實驗依據(jù)。