李 萍，沈?qū)W彬，周玉燕，李 艷，高 娃，陳靠山，王國(guó)棟

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2. 安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心；3. 活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

目前，結(jié)腸癌是人群中最為高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。近年來(lái)，中國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率都呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)[1]。在結(jié)腸癌的治療中，化療是主要的治療手段之一。結(jié)腸癌化療常用藥物奧沙利鉑、伊立替康等，都具有較大的毒副作用，且常因發(fā)生耐藥而失去作用，西妥昔單抗和貝伐單抗等發(fā)揮靶向治療作用的新型生物藥物也未能幸免[2]。因此，高效且低毒的新型天然抗結(jié)腸癌藥物越來(lái)越受到人們關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，許多多糖具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等其中的一種或多種生物學(xué)功能。多糖的抗腫瘤活性尤為引人注目，目前已提取出香菇多糖、黃芩多糖等多種具有抗結(jié)腸癌作用的多糖[3-4]。本課題組長(zhǎng)期從事抗腫瘤活性多糖藥物的篩選，目前已從黑根霉[5-6]、南極海洋菌[7]以及擬康氏木霉中，發(fā)現(xiàn)并提取出了具有抗腫瘤作用的活性多糖。擬康氏木霉胞外多糖(exopolysaccharide fromTrichodermapseudokoningii，EPS)是從擬康氏木霉發(fā)酵液中分離純化出的一種均一的多糖,分子質(zhì)量為31930 u，單糖組成及摩爾比為甘露糖 ∶葡萄糖 ∶半乳糖 ∶鼠李糖 ∶木糖 ∶果糖=25.8 ∶23.6 ∶48.1 ∶16.2 ∶14.4 ∶1。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前防治腫瘤研究的重要方向。前期研究已發(fā)現(xiàn)，EPS能夠誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562[8]和乳腺癌細(xì)胞MCF-7[9]凋亡。EPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞是否同樣具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，尚未可知。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116為研究對(duì)象，探索EPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、含EDTA胰酶(Gibco)；CCK-8試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、caspase-9檢測(cè)試劑盒、caspase-8檢測(cè)試劑盒、caspase-3檢測(cè)試劑盒(碧云天)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物)；結(jié)晶紫染色液(索萊寶)；抗體Bax、Bcl-2(Abclonal)；GAPDH抗體(CST)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Invitrogen)。

1.2 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Gold-SIM)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica)；蛋白電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)；流式細(xì)胞儀(BD)。

1.3 多糖的制備擬康氏木霉菌保種于本實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱。擬康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)PDA培養(yǎng)基活化后，液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)96 h(28 °C、135×g)。收集上層液體，3倍體積無(wú)水乙醇沉淀，12 000×g離心收集沉淀，采用木瓜蛋白酶聯(lián)合Sevag法脫蛋白(氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1，V/V)，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑后，過(guò)D301型大孔樹(shù)脂柱脫色，冷凍干燥后得到胞外粗多糖。粗多糖溶液過(guò)DEAE離子交換柱和G-75葡聚糖凝膠柱純化。收集主成分后凍干，命名為EPS。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含雙抗及10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱溫度37 ℃，CO2含量5%。

1.5 細(xì)胞增殖活力測(cè)定CCK-8法測(cè)定HCT116細(xì)胞的存活率。96孔板中細(xì)胞密度為每孔2×103個(gè)細(xì)胞，種板后培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，分別加入100 μL終濃度分別為0、50、100、200、400、800 mg·L-1的EPS溶液，每組5個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)24 h后，按照說(shuō)明書(shū)操作，450 nm處測(cè)定各孔的吸光值。細(xì)胞存活率/%=(A實(shí)驗(yàn)組-A調(diào)零孔)/(A空白對(duì)照組-A調(diào)零孔)×100%。

1.6 克隆形成率測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，使用含EDTA的胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液并吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度使每孔細(xì)胞數(shù)500個(gè)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入2 mL含不同濃度EPS的培養(yǎng)基，使終濃度分別為0、125、250、500 mg·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)。6 d后取出6孔板，棄去原培養(yǎng)液，使用PBS洗滌3次后，加入1 mL色譜甲醇固定10 min。棄去色譜甲醇，加入0.5%結(jié)晶紫溶液1 mL，室溫染色30 min，回收結(jié)晶紫溶液，蒸餾水洗板，自然風(fēng)干后拍攝照片。

1.7 Annexin V-FITC/PI流式雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，接種細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后，每孔加入1 mL含不同濃度EPS的新鮮培養(yǎng)基，使終濃度分別為0、125、250、500 mg·L-1，24 h后收集培養(yǎng)基及細(xì)胞，離心，設(shè)對(duì)照管和單陽(yáng)管及實(shí)驗(yàn)管，F(xiàn)ITC單陽(yáng)管和實(shí)驗(yàn)管先加入FITC避光室溫孵育5 min，PI單陽(yáng)管和實(shí)驗(yàn)管加入PI后立刻300目過(guò)濾細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm)取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，接種至激光共聚焦小皿，每孔0.5 mL，24 h后，每孔加入0.5 mL含不同濃度EPS的新鮮培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0、125、250、500 mg·L-1，24 h后吸棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入適量JC-1染色工作液和染色緩沖液，激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體膜電位變化。

1.9 Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，接種細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后，每孔加入1 mL含不同濃度EPS的新鮮培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0、125、250、500 mg·L-1，24 h后，洗滌細(xì)胞后，加入PMSF的裂解液，放置于水平搖床，冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×g冷凍離心30 min，收集上清，測(cè)定各組蛋白質(zhì)的濃度，并調(diào)整各組濃度使其一致。各組取10 μL蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)電泳分離目的蛋白，并將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶粉搖床封閉90 min。加入稀釋的一抗(Bax、Bcl-2、GAPDH)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入二抗，室溫孵育2 h，加入曝光液后放入曝光機(jī)中，獲得目的蛋白表達(dá)情況。

1.10 試劑盒檢測(cè)caspase-9、caspase-8、caspase-3活性取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，接種細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后每孔加入1 mL含不濃度EPS的新鮮培養(yǎng)基(0、125、250、500 mg·L-1)，48 h后收集原細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞，離心收集沉淀，PBS洗滌后，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液，重懸沉淀，冰上裂解15 min。4 °C、18 000×g離心15 min，收集上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)caspase-9、caspase-8和caspase-3酶活性。

2 結(jié)果

2.1 EPS對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法分析了EPS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116存活率的影響。Fig 1A結(jié)果顯示， EPS作用細(xì)胞24 h，在100～800 mg·L-1濃度范圍能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞存活，EPS作用細(xì)胞48 h，在50～800 mg·L-1濃度范圍能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞存活，并隨著時(shí)間的增加和劑量的增大，作用逐漸增強(qiáng)。Fig 1B結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度EPS處理后，HCT116細(xì)胞克隆數(shù)降低，差異具有顯著性(見(jiàn)Fig 1C)。

2.2 EPS對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig 2結(jié)果顯示，EPS(0、125、250、500 mg·L-1)作用于HCT116細(xì)胞48 h，流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，凋亡率分別為(10.21±2.04)%、(32.44±1.70)%、(50.77±2.36)%、(67.27±5.05)%，隨著給藥濃度的增加，凋亡比例逐漸上升，與對(duì)照組相比，EPS能明顯誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡(P<0.01)。

2.3 EPS對(duì)HCT116細(xì)胞線粒體膜電位的影響使用不同濃度EPS(0、125、250、500 mg·L-1)處理HCT116細(xì)胞后，進(jìn)行JC-1染色發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度的加大，綠色熒光逐漸增加，紅色熒光逐漸減少(Fig 3)。

2.4 EPS對(duì)HCT116細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig 4A結(jié)果表明，EPS (0、125、250、500 mg·L-1) 處理HCT116細(xì)胞后，隨著給藥濃度增大，Bcl-2蛋白表達(dá)量逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)量卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值逐漸下降 ，結(jié)果與空白對(duì)照組相比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4B)。Fig 4C結(jié)果表明，當(dāng)EPS(125、250、500 mg·L-1)作用HCT116細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，caspase-9、caspase-8以及caspase-3酶活性均明顯升高。 caspase-9活性升高的百分比均值分別為21.04%、32.33%、42.67%，caspase-3酶活性升高的百分比均值分別為28.67%、47.62%、60.33%。

Fig 1 Effects of EPS on proliferation of HCT116 cells

Fig 2 Effects of EPS on apoptotic rate of HCT116 cells n=3) **P<0.01 vs control.

Fig 3 Effect of EPS on cell mitochondrial membrane potential of HCT116 cells

3 討論

腫瘤細(xì)胞本身可產(chǎn)生生長(zhǎng)因子受體，從而不能實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為持續(xù)的增殖信號(hào)刺激，無(wú)限的分裂增殖[10]。是否具有增殖抑制作用是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物是否有效的重要指標(biāo)。本研究CCK-8結(jié)果顯示，EPS可抑制HCT116細(xì)胞增殖，克隆形成實(shí)驗(yàn)則證明EPS能抑制HCT116細(xì)胞克隆形成，表明EPS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116具有增殖抑制作用。

Fig 4 Effects of EPS on expression of apoptosis-related proteins in HCT116 cells n=3)

A: Protein levels of Bcl-2, Bax, Bcl-2/Bax; B: Data analysis of A; C: Effects of EPS on caspase-9, caspase-8 and caspase-3 activity in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

細(xì)胞凋亡又被稱為細(xì)胞程序性死亡，其對(duì)于維持一個(gè)多細(xì)胞生物的組織或器官的完整性和平衡性，具有不可替代的重要作用。凋亡是增殖的屏障，可以阻止腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，凋亡逃逸被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志之一[11]。“凋亡觸發(fā)”由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡控制。抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子為代表；促進(jìn)凋亡發(fā)生的分子，以Bax分子為代表。隨著EPS加入濃度的增大，Bcl-2/Bax比值逐漸降低。由此可見(jiàn)，Bcl-2蛋白家族參與了EPS誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡作用。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)隨著EPS濃度的提高，線粒體表現(xiàn)為去極化作用增強(qiáng)，跨膜電位丟失。EPS導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降，Bcl-2表達(dá)降低，Bax基因表達(dá)增加，caspase-9釋放，最終激活效應(yīng)分子caspase-3，引起結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。因此，EPS誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116凋亡可能是通過(guò)線粒體途徑，但caspase-8的活性也同時(shí)增強(qiáng)，因此，腫瘤壞死因子(TNF)受體家族也可能參與了EPS誘導(dǎo)HCT116凋亡。另外，Bax與Bcl-2共用蛋白-蛋白相互作用域，即BH3基序，而與自噬密切相關(guān)的Beclin-1蛋白是BH3凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族成員，EPS也可能誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，激活或抑制了腫瘤細(xì)胞的自噬作用。

EPS為真菌發(fā)酵提取物，和其他動(dòng)植物中提取的具有抗腫瘤作用的多糖相比，其生產(chǎn)不受季節(jié)因素的影響，也不需要較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期，所需場(chǎng)地面積小，適合后期的大規(guī)模量產(chǎn)。近幾年，人們已從單一的植物中尋找天然抗腫瘤藥物逐漸轉(zhuǎn)向細(xì)菌、真菌等微生物，尤其是各類微生物的發(fā)酵產(chǎn)物以及次生代謝產(chǎn)物[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，擬康氏木霉發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖對(duì)CT26結(jié)腸癌移植鼠具有抑瘤作用[13]，本研究證明，EPS可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，并可能通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，為該多糖開(kāi)發(fā)為抗結(jié)腸癌藥物提供了新的證據(jù)，也為微生物發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤物質(zhì)，提供了新依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。化療藥物常以抑制免疫作用為代價(jià)，而擬康氏木霉多糖抑制腫瘤的同時(shí)卻可提高機(jī)體免疫功能[14]，因此是較為理想的抗腫瘤潛在藥物。當(dāng)然，該多糖是否可以作為一種有效的輔助手段用腫瘤的治療，還需進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更加深入的研究。

(感謝皖南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室和安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，感謝中心實(shí)驗(yàn)室余浩、呂夢(mèng)娟、竇德宇老師的協(xié)助，感謝多糖中心柳春燕和袁平川老師及陳雨婷、闕月月等同學(xué)的支持與協(xié)助。)