袁 慶，胡利民，賈壯壯，殷孟蘭，王少峽，郭 虹，柴麗娟

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301600)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分，在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。在缺血/再灌注等病理?yè)p傷下，AS形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化：一方面，通過分泌炎癥因子等，加重腦損傷；另一方面，激活的AS會(huì)釋放大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)等，其大量表達(dá)能支持和營(yíng)養(yǎng)受損神經(jīng)元，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[1]。心腦舒通膠囊是由蒺藜地上全草部分經(jīng)干燥提取后制成的膠囊劑，具有活血化瘀、扶正養(yǎng)生、預(yù)防腦動(dòng)脈硬化的藥理作用[2]。相關(guān)研究表明，心腦舒通膠囊具有改善缺血/再灌注損傷大鼠腦神經(jīng)功能，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞及AS功能的作用[3]。但心腦舒通膠囊發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用是否通過促進(jìn)AS神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，以及其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)并未研究。本實(shí)驗(yàn)通過原代培養(yǎng)得到AS，給予氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)損傷處理，模擬腦缺血/再灌注損傷模型，探討心腦舒通膠囊及其有效組分對(duì)損傷AS細(xì)胞活力及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑出生1～2 d Wistar乳鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 中心，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。心腦舒通膠囊(吉林敖東股份有限公司)；單體化合物(由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院張鵬老師提供)：①原薯蕷皂苷(protodioscin)，②化合物Ⅱ-14A：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-5α-呋甾-20(22-烯-3β，26-二醇-3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷})，③化合物Ⅱ-5A：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-呋甾烷-4(5), 20(22)-二烯-3，12-二酮)；Cell Counting Kit-8(日本DOJINDO)；PCR試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems)；抗GFAP、BDNF抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology)。

1.2 方法

1.2.1AS的原代培養(yǎng)及鑒定 參照湯婷婷等[4]的方法，體外原代培養(yǎng)Wistar大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，略有改動(dòng)，并采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫染色法鑒定。

1.2.2細(xì)胞分組和處理 對(duì)照組：將培養(yǎng)液換為高糖緩沖液，正常培養(yǎng)4 h后，換DMEM/F12培基；模型組：將培養(yǎng)液換為無(wú)糖緩沖液，并放于缺氧小室內(nèi)，向小室內(nèi)持續(xù)充入94% N2+5% CO2+1% O2的混合氣體5 min后，關(guān)閉缺氧小室，4 h后換成DMEM/F12培基；加藥組：在模型組缺氧4 h后，換含藥DMEM/F12培基。所有組繼續(xù)正常培養(yǎng)20 h。

1.2.3藥物對(duì)正常及損傷AS細(xì)胞增殖能力的影響 將正常培養(yǎng)AS上清換為含藥培基，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行“1.2.2”所述缺氧/復(fù)氧處理，復(fù)氧時(shí)加入不同濃度心腦舒通膠囊及單體，復(fù)氧20 h后加入CCK-8，檢測(cè)450 nm處OD值。

1.2.4藥物對(duì)AS細(xì)胞GDNF、NGF mRNA表達(dá)的影響 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行“1.2.2”所述缺氧/復(fù)氧及加藥處理。復(fù)氧時(shí)，用Trozol法提取RNA，并按照SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。用ABI 7500 RT-PCR儀獲得每個(gè)樣品反應(yīng)的Ct值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。引物序列如下：β-actin: F:5′-AGAGGGAAATCGTGC-3′, R: 5′-CGATAGTGATGACCT-3′；NGF：F: 5′-GGACGCAGCTTTCTATCCTGG-3′，R: 5′-CCCTCTGGGACATTGCTATCTG-3′；GDNF：F: 5′-AGCTGCCAGCCCAG AATT-3′，R: 5′-GCACCCCCGATTTTTGC-3′。所用引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.5藥物對(duì)BDNF蛋白表達(dá)的影響 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行“1.2.2”所述缺氧/復(fù)氧及加藥處理。復(fù)氧時(shí)裂解細(xì)胞提取蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將PVDF膜置于抗BDNF、β-actin抗體中，4 ℃孵育過夜。次日加入IgG-HRP抗體后曝光，用蛋白條帶的灰度值計(jì)算相應(yīng)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)正常及損傷AS細(xì)胞增殖能力的影響如Tab 1所示，與對(duì)照組比較，心腦舒通及3個(gè)單體對(duì)AS增殖能力無(wú)明顯影響(P>0.05)，提示藥物對(duì)AS沒有毒性。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通膠囊(25、50 mg·L-1)及3個(gè)單體均能明顯提高受損細(xì)胞活力(P<0.05)。選取心腦舒通25 mg·L-1濃度及3個(gè)單體進(jìn)行機(jī)制研究。

Tab 1 Effect of drugs on viability of normal and OGD/R treatment in AS cells n=6)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

2.2 藥物對(duì)損傷AS細(xì)胞GDNF、NGF mRNA及BDNF蛋白表達(dá)的影響如Tab 2所示，與對(duì)照組比較，模型組能明顯增加GDNF、NGF的mRNA表達(dá)，降低BDNF蛋白表達(dá)(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通及Ⅱ-14A均能明顯增加GDNF、NGF mRNA表達(dá)及BDNF蛋白表達(dá)，Ⅱ-5A能明顯誘導(dǎo)GDNF mRNA表達(dá)(P<0.05)。

Tab 2 Effect of drugs on GDNF and NGF mRNA and BDNF protein in OGD/R injured AS n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

3 討論

本研究在心腦舒通膠囊全方的基礎(chǔ)上，同時(shí)選取3個(gè)皂苷類活性成分進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致AS中BDNF表達(dá)明顯降低[5]，而應(yīng)激激活后，GDNF、NGF mRNA表達(dá)水平明顯升高[6-7]。心腦舒通膠囊和化合物Ⅱ-14A能進(jìn)一步誘導(dǎo)GDNF、NGF mRNA表達(dá)和BDNF蛋白表達(dá)，保護(hù)受損的星形膠質(zhì)細(xì)胞。提示心腦舒通膠囊全方及其單體成分對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放有促進(jìn)作用，其中化合物Ⅱ-14A對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放與心腦舒通膠囊具有相似的作用功效，可作為研究心腦舒通膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的候選單體藥物，為心腦舒通膠囊及其有效成分的再次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。