董 易，褚冬青，馬春宇，黃建華，王 一

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1. 檢驗(yàn)科、2. 外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000)

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一,與其他口腔惡性腫瘤相比，其惡性程度高，生長快，浸潤性強(qiáng)[1]。在過去的幾十年中，盡管對TSCC的診斷和治療取得了進(jìn)展，但發(fā)病率和死亡率并沒有降低。舌癌的主要治療策略是徹底的外科手術(shù)和放化療，由于其早期癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，失去了最佳的手術(shù)治療時(shí)期，而化療藥的毒副作用較大，因此，尋找毒副作用少且對舌癌有抑制作用的藥物尤為重要。積雪草酸(asiatic acid，AA)屬于五環(huán)三萜酸，結(jié)構(gòu)見Fig 1,主要來源于傘形科植物積雪草(Centella asiatica)，最早常用于促進(jìn)傷口愈合。近年來，已發(fā)現(xiàn)AA具有許多生物活性，如抗炎護(hù)膚、保肝、降血糖、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)，引起了人們極大的研究興趣[2-3]。近年來一些研究顯示，AA也是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡且毒副作用小的天然產(chǎn)物。Wu等[4]在裸鼠成瘤模型上證實(shí)，AA可以抑制肺癌腫瘤的生長，而對正常細(xì)胞無明顯影響。AA對舌癌TCA-8113細(xì)胞的抗腫瘤作用尚未有報(bào)道，因此，本研究觀察了AA體外對舌癌TCA-8113細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響，并探討了其可能的作用機(jī)制。

Fig 1 Chemical structural of asiatic acid

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人舌癌TCA-8113細(xì)胞，由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.1.2藥物與試劑 AA(貨號:464-92-6,批號:JZ18030112)，購自南京景竹生物科技有限公司，純度>98%，分子式C30H48O5，分子質(zhì)量488.7，溶于DMSO，DMSO終濃度小于0.1%。MTT、Hoechst 33342、二甲基亞砜(DMSO)、結(jié)晶紫(北京Solarbio公司)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(沈陽萬類生物科技公司)；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；ECL Plus試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica)；流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Biotek)；MINIVE垂直蛋白電泳(美國Amersham Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 舌癌TCA-8113細(xì)胞用含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640,放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換1次液，細(xì)胞生長到皿底80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。

1.2.2MTT檢測TCA-8113細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期TCA-8113細(xì)胞，將每孔約8×103個(gè)細(xì)胞置于96孔板中至細(xì)胞貼壁，棄舊培養(yǎng)液，每孔加入含不同濃度AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)的100 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加150 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值。細(xì)胞活力/%=(OD給藥組-OD空白組/OD對照組-OD空白組)×100% 。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測TCA-8113細(xì)胞克隆形成 取對數(shù)生長期細(xì)胞，鋪6孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞約1×103個(gè)，設(shè)置對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，作用時(shí)間為1周，每2 d換液1次，藥物濃度保持不變。然后用PBS輕輕漂洗2次；甲醇固定30 min，PBS輕輕漂洗3次；結(jié)晶紫染色25 min，PBS漂洗4～5次；晾干，相機(jī)拍照。

1.2.4Hoechst 33342染色觀察TCA-8113細(xì)胞凋亡形態(tài) 取對數(shù)生長期的TCA-8113細(xì)胞，6孔板中每孔約鋪1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿孔底80%，設(shè)對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，加入10 mg·L-1Hoechst 33342染色液(1 000 ∶1)，染色15 min后，PBS洗3次，用熒光顯微鏡(×200)觀察細(xì)胞形態(tài)，并記錄圖像。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測TCA-8113細(xì)胞的凋亡率 培養(yǎng)細(xì)胞至對數(shù)生長期，設(shè)空白對照組、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)處理組，作用24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，取約4×105～5×105個(gè)細(xì)胞，并在離心管中1 200 r·min-1離心5 min。用預(yù)冷PBS混勻，沖洗，取100 μL流式緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，避光4 ℃孵育15 min，再加400 μL的PBS，移入流式管中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。Q1區(qū)表示壞死細(xì)胞及機(jī)械損傷細(xì)胞，Q2表示晚期凋亡細(xì)胞，Q3表示活細(xì)胞，Q4表示早期凋亡細(xì)胞。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)分析TCA-8113細(xì)胞周期 收集用AA處理24 h的細(xì)胞及對照組細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒的說明調(diào)整細(xì)胞密度，固定，添加RNaseA，并添加碘化丙啶染色溶液，轉(zhuǎn)移到流式管中，上機(jī)分析細(xì)胞周期。

1.2.7Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)作用TCA-8113細(xì)胞24 h，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，在冰盒上用細(xì)胞裂解液(裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)將細(xì)胞裂解30 min，每8 min搖動(dòng)1次，4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min。BCA蛋白試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，制樣并在沸水中變性10 min。取蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，電濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用3% BSA封閉液封閉1.5 h后，加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，以TBST漂洗后，加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，用TBST沖洗3次，最后用ECL顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 AA抑制TCA-8113細(xì)胞的增殖Fig 2的MTT結(jié)果顯示，隨著AA濃度的增加，人舌癌TCA-8113細(xì)胞的活力明顯降低，其作用24 h的IC50值為42.13 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of AA on viability of TCA-8113

**P<0.01vscontrol

2.2 AA對TCA-8113細(xì)胞克隆形成能力的影響如Fig 3所示，對照組細(xì)胞克隆形成能力為100%，隨著AA濃度的增大，克隆形成能力明顯降低(P<0.01)。

Fig 4 Effect of AA on nuclear morphology change of TCA-8113 cells(×200)

2.3 AA對TCA-8113細(xì)胞凋亡的影響Hoechst 33342染色時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察到正常細(xì)胞核顯示出弱的藍(lán)光，而凋亡細(xì)胞核顯示出致密的亮藍(lán)色熒光。如Fig 4所示，對照組TCA-8113細(xì)胞核呈微弱熒光，隨著AA濃度的增大，細(xì)胞核的藍(lán)色熒光致密且亮，與AA濃度呈正比。流式細(xì)胞儀結(jié)果如Fig 5所示，AA(20、30、40、50 μmol·L-1)逐漸誘導(dǎo)TCA-8113細(xì)胞的凋亡。

2.4 AA阻滯TCA-8113細(xì)胞周期于G2/M期流式分析細(xì)胞周期分布情況，檢測細(xì)胞周期改變是否參與AA誘導(dǎo)TCA-8113細(xì)胞凋亡的過程。Fig 6、Tab 1結(jié)果顯示，不同濃度AA作用24 h后，TCA-8113細(xì)胞在G2/M期明顯停滯(P<0.05)。

2.5 AA對TCA-8113細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3表達(dá)的影響如Fig 7所示，與對照組相比，AA組Bcl-2表達(dá)降低，而Bax、cleaved caspase-3蛋白水平均明顯增加，具有一定程度的濃度依賴性(P<0.01)。

Tab 1 Cell cycle analysis of TCA-8113 cells treated with AA for 24 n=3)

*P<0.05vscontrol group

2.6 AA促進(jìn)TCA-8113細(xì)胞中p53信號通路的激活如Fig 8所示，AA呈濃度依賴性增加p53、p21蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

3 討論

TSCC是全球口腔癌中發(fā)病率和死亡率的主要原因，全世界約50%的舌癌患者存在晚期疾病, 經(jīng)手術(shù)完整切除后，癌癥仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。因此，如何抑制舌鱗癌的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，是目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)問題。AA可抑制各種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和肺癌的增殖和分化。然而，特異性抗癌機(jī)制非常復(fù)雜，涉及線粒體凋亡和細(xì)胞周期分布。Aktarul等[5]研究表明，在大鼠結(jié)腸癌模型中，AA能抑制癌前病變、炎癥、細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而對結(jié)腸黏膜細(xì)胞無毒性作用。Chen等[6]研究表明，AA能抗順鉑引起的急性腎損傷，對小鼠的正常細(xì)胞無影響。以上研究結(jié)果說明，AA有可能作為低毒高效的抗腫瘤藥物應(yīng)用。本研究利用不同濃度的AA處理人舌癌TCA-8113細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示，其IC50值為42.13 μmol·L-1，確定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用AA濃度(20、30、40、50 μmol·L-1)，即達(dá)到了抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的效果，又不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。此外，AA處理的舌癌細(xì)胞的克隆生長被阻斷，進(jìn)一步證實(shí)了AA的抗腫瘤活性，但其作用機(jī)制不明。

Fig 5 Effect of AA on apoptosis of TCA-8113 *P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 6 Cell cycle distribution of TCA-8113 cells after treatment with AA for 24

Hoechst 33342染色是觀察AA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡變化的最直觀方法。隨著AA濃度的增高，舌癌TCA-8113細(xì)胞體積大小不一，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈致密濃染的顆粒狀熒光，在凋亡細(xì)胞中，清楚地觀察到具有高藍(lán)色熒光強(qiáng)度的凋亡小體。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測AA作用于舌癌TCA-8113細(xì)胞后熒光強(qiáng)度，反映凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AA處理TCA-8113細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，最高可達(dá)79.42%。

細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)為核凝聚和碎裂，凋亡小體出現(xiàn)，未見質(zhì)膜破裂。目前，已知腫瘤細(xì)胞凋亡通路有多種，主要依賴線粒體通路和凋亡受體通路兩種方式。在細(xì)胞凋亡過程中，許多凋亡信號匯聚于線粒體，Bcl-2家族成員通過整合凋亡信號，使細(xì)胞色素C釋放，協(xié)調(diào)caspase-3激活，從而使線粒體外膜的通透性增加[7]。p53蛋白分子作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠上調(diào)Bax的表達(dá)，從而對抗Bcl-2的抗凋亡作用[8]。Bcl-2族系的凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2、Bax、Bcl-xl都錨定于線粒體膜中，它們能阻止或促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而影響細(xì)胞的程序性死亡[9-10]。Bax表達(dá)增加能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而Bcl-2抗凋亡蛋白能夠保持線粒體完整性來阻止細(xì)胞色素C的釋放。因此，Bcl-2蛋白表達(dá)降低有利于細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，有助于caspase-3激活，活化的caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)記物[11]。本研究Western blot結(jié)果顯示，AA抑制Bcl-2表達(dá)的同時(shí)，增加Bax的表達(dá)，導(dǎo)致caspase-3表達(dá)增加，且呈濃度依賴性。

Fig 7 Effect of AA on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in TCA-8113

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 8 Effect of AA on expression of p53 and p21

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

細(xì)胞周期控制是一個(gè)高度調(diào)控的過程，涉及一系列復(fù)雜的信號，大多數(shù)癌細(xì)胞在G1檢查點(diǎn)發(fā)生分裂，導(dǎo)致依賴G2檢查點(diǎn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制。正常細(xì)胞依靠G1檢查點(diǎn)來保護(hù)自己免受DNA損傷。因此，影響G2/M細(xì)胞周期的藥物對正常細(xì)胞的危害較小[12]。p53作為一種腫瘤抑制蛋白，通過誘導(dǎo)p21依賴性細(xì)胞周期阻滯或凋亡，來控制細(xì)胞對刺激因素應(yīng)激的長期反應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)分析舌癌TCA-8113細(xì)胞的細(xì)胞周期，不同濃度的AA作用TCA-8113細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期在G2/M期逐漸被阻斷，且呈濃度依賴性。此外，我們檢測了p53及p21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AA處理后p53和p21上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，AA誘導(dǎo)的G2/M期阻滯與p53、p21上調(diào)有關(guān)。這與Hsu等[14]報(bào)道的AA可以誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞阻滯在S-G2/M期，以及Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞中，AA處理也導(dǎo)致G2/M期阻滯相一致。

綜上所述，本研究表明，AA抑制舌癌TCA-8113細(xì)胞的增殖作用主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯在G2/M期來完成。AA誘導(dǎo)TCA-8113細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)控p53通路相關(guān)蛋白p53、p21、Bax及抑制Bcl-2有關(guān)。隨后的實(shí)驗(yàn)將探索AA抑制細(xì)胞增殖和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的更多分子機(jī)制。