張小敏，高 磊,2，胡 瀟，聶玲輝，陳育堯，莫志賢，朱玲玲,2

(南方醫(yī)科大學(xué) 1. 中醫(yī)藥學(xué)院、2. 南方醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510515；3. 廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動(dòng)傷害康復(fù)研究所，廣東 廣州 510317)

重型再生障礙性貧血(severe aplastic anemia，SAA)是以全血細(xì)胞減少、骨髓增生重度減低為特征的骨髓衰竭綜合征，目前發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[1]。國(guó)內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，免疫介導(dǎo)骨髓衰竭小鼠模型是一個(gè)最接近SAA發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型[2]。在建立免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭(bone marrow failure，BMF)小鼠模型過(guò)程中，亞致死劑量射線輻照是必需條件[3-4]。我們?cè)谔幚砟Ｐ托∈髸r(shí)發(fā)現(xiàn)，腎、肝臟等多臟器蒼白，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4-5]。相關(guān)研究證實(shí)輻射會(huì)導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]，而貧血可進(jìn)一步加重腎臟氧化應(yīng)激損傷[7]，但在建立免疫介導(dǎo)的BMF模型過(guò)程中誘導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激尚未見報(bào)道。

川芎嗪((tetramethylpyrazine，TMP)是從中藥川芎中提取出來(lái)的活性生物堿，具有抑制血小板聚集、清除自由基、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用[8]，并能減輕輻射誘導(dǎo)的DNA損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[9]，臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管、呼吸系統(tǒng)、腎臟等疾病治療，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了其治療腎缺血/再灌注損傷及膜性腎病的有效性[10-11]。然而，TMP是否對(duì)BMF小鼠腎臟氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究旨在探討川芎嗪對(duì)BMF小鼠腎臟氧化應(yīng)激的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 ♀小鼠，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量(15～18) g，共60只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(粵)2016-0167，在SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。DBA/2 ♀小鼠14只，6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2藥物與試劑 川芎嗪?jiǎn)误w(生產(chǎn)批號(hào)：18101001，成都曼思特生物科技有限公司)；微量還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為：A006-2、A001-1、A005、A003-1)；HIF-1α抗體(ab1，Abcam)；VEGFA抗體(A17877，ABclonal Technology)。

1.1.3儀器 輻照儀(MultiRad)；輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(Leica)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(邁瑞B(yǎng)C-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀)；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus)。

1.2 動(dòng)物分組與處理按隨機(jī)數(shù)字表法，將受體C57BL/6小鼠分為正常對(duì)照組、單純輻照組、模型組、TMP低、中、高劑量組，每組10只。頸椎脫位法處死供體DBA/2小鼠，于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡5 min，無(wú)菌操作取其頸部、腋下、腸系膜淋巴結(jié)及胸腺，加PBS緩沖液，輕輕研磨后，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，按胸腺細(xì)胞 ∶淋巴結(jié)細(xì)胞=1 ∶2制成淋巴細(xì)胞混懸液，配成細(xì)胞懸液濃度為2×1010·L-1。

1.3 免疫介導(dǎo)的BMF模型的建立受體C57BL/6小鼠經(jīng)5.0 Gy X射線全身均勻照射后，4 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入DBA/2小鼠淋巴細(xì)胞混懸液0.2 mL，含4×106個(gè)淋巴細(xì)胞。14 d后處理各組小鼠，模型成功判定標(biāo)準(zhǔn):①血細(xì)胞計(jì)數(shù)：全血細(xì)胞減少；②骨髓活檢：骨髓多部位增生不良或低下，巨核細(xì)胞缺如，非造血細(xì)胞比例增多。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1血細(xì)胞檢測(cè)與骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù) 在小鼠瀕死狀態(tài)或存活14 d后，采用摘眼球取血法采血,置于EDTA抗凝管中，檢測(cè)各組小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)。取右側(cè)股骨，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔直至股骨發(fā)白，留取骨髓細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)量。

1.4.2骨髓與腎臟病理學(xué)檢查 取左側(cè)股骨，浸泡于脫鈣液中至股骨軟化后，用自來(lái)水浸泡2 h，置于10%中性甲醛固定72 h；取各組腎臟置于10%中性甲醛固定72 h。以上組織經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、半薄切片及蘇木精-伊紅染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察正常對(duì)照組、單純輻照組、模型組和給藥組之間骨髓與腎臟病理學(xué)變化。

1.4.3腎臟氧化應(yīng)激檢測(cè) 取腎臟組織100 mg, 經(jīng)冰冷PBS漂洗和裂解液勻漿后，于4 ℃、10 000×g離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用試劑盒檢測(cè)MDA、SOD、GSH和GSH-Px活性水平，按照說(shuō)明書操作。

1.4.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 將腎組織石蠟切片經(jīng)烤片和常規(guī)脫蠟至水后，經(jīng)熱修復(fù)抗原，于3%過(guò)氧化氫溶液中滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及BSA封閉后，滴加一抗HIF-1α、VEGF，37 ℃烤箱中孵育0.5 h；室溫下復(fù)溫5 min，滴加二抗，37 ℃烘箱中孵育20 min，DAB顯色2～5 min，于顯微鏡下觀察顯色情況，經(jīng)蘇木精復(fù)染和中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定：胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。應(yīng)用ImageJ圖像處理軟件計(jì)算平均光密度來(lái)分析表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 外周血細(xì)胞檢測(cè)與骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab 1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型小鼠在瀕死狀態(tài)或存活14 d后，外周血三系紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和骨髓有核細(xì)胞數(shù)量都明顯下降(P<0.01)，尤其白細(xì)胞下降最明顯；與模型組相比，TMP給藥組紅細(xì)胞出現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中TMP高劑量組上升最明顯(P<0.05)；與模型組相比，TMP給藥組血小板出現(xiàn)上升，其中TMP低劑量組增加最明顯(P<0.01)；與模型組相比，TMP高劑量組有核細(xì)胞明顯上升(P<0.05)。

2.2 骨髓病理學(xué)改變Fig 1的骨髓病理可見，正常對(duì)照組造血組織結(jié)構(gòu)完整，造血細(xì)胞分布均勻，造血細(xì)胞增殖旺盛；而模型組有核細(xì)胞明顯減少，巨核細(xì)胞缺如，大量脂肪空泡代替造血細(xì)胞。TMP給藥各組骨髓有核細(xì)胞增加，隨TMP給藥劑量的增加，骨髓有核細(xì)胞增加越明顯。

Fig 1 Bone marrow pathology of each group (HE ×200)

A: Control group; B: TBI group; C: Model group; D: TMP low dose group; E: TMP medium dose group; F: TMP high dose group.

Tab 1 Blood cell counting and bone marrow nucleated cell counting of each

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vscontrol

2.3 川芎嗪對(duì)腎臟病理的影響Fig 2的腎臟病理可見，模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞水腫，但無(wú)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；TMP給藥各組未見明顯的腎臟病理學(xué)改變。

Fig 2 Renal pathology of each group (HE×400)

A: Control group; B: TBI group; C: Model group; D: TMP low dose group; E: TMP medium dose group; F: TMP high dose group.

2.4 川芎嗪對(duì)腎臟氧化應(yīng)激的影響Tab 2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組腎臟MDA含量明顯升高(P<0.05)；TMP中、高劑量組及單純輻照組腎臟中MDA含量與模型組相比明顯降低(P<0.05,P<0.01)。相比于正常對(duì)照組，模型組的SOD活力明顯降低(P<0.05)；TMP高劑量組SOD活力與模型組相比明顯升高(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，單純輻照組、模型組、TMP低劑量組腎臟GSH含量明顯下降(P<0.01)；TMP中、高劑量組GSH含量與模型組相比明顯升高(P<0.01)。與正常對(duì)照組相比，模型組GSH-Px活力明顯下降(P<0.05)，而單純輻照組、TMP給藥各組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 川芎嗪對(duì)腎臟組織中HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響 經(jīng)免疫組化檢測(cè)，正常對(duì)照組未見HIF-1α表達(dá)，單純輻照組小鼠腎小球基底膜區(qū)可見少量棕黃色的陽(yáng)性顆粒表達(dá)，模型組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)量明顯增多；經(jīng)TMP治療后，與模型組相比，TMP中、高劑量組HIF-1α明顯下降(P<0.01)，TMP高劑量組幾乎未見HIF-1α表達(dá)，見Fig 3。正常對(duì)照組、單純輻照組、模型組小鼠未見VEGF表達(dá)，但經(jīng)川芎嗪干預(yù)后，TMP低、中劑量組腎血管旁腎小管出現(xiàn)VEGF表達(dá)(Fig 4)。

Fig 3 Expression of HIF-1α in renal tissues by immunohistochemical staining (×400)

A: Control group; B:TBI group; C: Model group; D:TMP low dose group; E: TMP medium dose group; F: TMP high dose group.**P<0.01vsmodel;##P<0.01vscontrol

Tab 2 MDA, SOD, GSH and GSH-Px contents of kidney tissues in each

*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vscontrol

Fig 4 Expression of VEGF in renal tissues by immunohistochemical staining (×400)

A: Control group; B:TBI group; C: Model group; D:TMP low dose group; E: TMP medium dose group; F: TMP high dose group.**P<0.01vsmodel;##P<0.01vscontrol

3 討論

免疫介導(dǎo)的BMF模型作為最接近SAA患者發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型[2]，目前國(guó)內(nèi)外大多采用輻照結(jié)合淋巴細(xì)胞輸注的方法建立免疫介導(dǎo)的BMF動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)X射線輻照結(jié)合淋巴細(xì)胞輸注造模14 d后，模型組小鼠外周血三系和骨髓有核細(xì)胞均明顯減少，骨髓病理可見脂肪空泡、巨核細(xì)胞缺如，說(shuō)明成功建立免疫介導(dǎo)的BMF小鼠模型。既往研究表明，多種致病因素如輻照、缺血缺氧、炎癥等都可導(dǎo)致腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟病理切片顯示，模型組小鼠腎小管水腫，檢測(cè)腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA明顯上升，而抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH、GSH-Px出現(xiàn)明顯下降，單純輻照組小鼠腎臟GSH明顯下降，提示單純輻照及造模都可導(dǎo)致小鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)。

缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是一種細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧的反應(yīng)元件，已被證明在輻射損傷后被激活和上調(diào)表達(dá)[12]，并參與多種應(yīng)激反應(yīng)。TMP作為一種有效的抗氧化劑，能夠降低多種原因誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，還能降低HIF-1α的表達(dá)[13]。并且HIF-1α參與調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，而VEGF能通過(guò)誘導(dǎo)新血管的形成來(lái)重塑腎血流動(dòng)力學(xué)[14]。那么，TMP能否通過(guò)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路來(lái)減輕BMF小鼠腎臟因輻照與嚴(yán)重貧血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，值得深入探討。

在本實(shí)驗(yàn)中，單純輻照及造模后小鼠腎臟都存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且HIF-1α蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明單純輻照及造模后腎臟氧化應(yīng)激可能與HIF-1α表達(dá)有關(guān)。給予TMP干預(yù)后，BMF小鼠腎臟無(wú)明顯的病理學(xué)改變，TMP中、高劑量組腎臟MDA下降，而SOD、GSH上升，氧化與抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)平衡，腎小球中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯下降、腎小管中出現(xiàn)VEGF蛋白表達(dá)，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)，在HIF-1α降解的條件下，VEGF能被連續(xù)合成和持續(xù)表達(dá)[14]，表明TMP可能通過(guò)抑制HIF-1α及上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，即通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路，從而減少模型小鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)小鼠腎臟的作用。

綜上所述，TMP對(duì)免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭C57BL/6小鼠模型腎臟氧化應(yīng)激具有良好保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能涉及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路調(diào)控。