顧倩倩，劉 翠，方偉彬，劉培慶，李 民

(中山大學(xué)藥學(xué)院，新藥成藥性評(píng)估與評(píng)價(jià)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是一種由14個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，最早于1968年從大鼠的下丘腦中被分離出來[1]。SST可作用于多種器官，包括大腦、垂體、腸道、胰腺、腎上腺、甲狀腺和腎臟等，在機(jī)體內(nèi)主要發(fā)揮內(nèi)源性的抑制作用[2]。SST主要適用于急性胰腺炎，上消化道出血，胰、膽、腸瘺的輔助治療，肢端肥大癥等[3-4]。內(nèi)源性的SST半衰期較短，通常只有1～3 min，臨床上常用的生長(zhǎng)抑素制劑有思他寧、奧曲肽和蘭瑞肽。為了開發(fā)更多作用時(shí)間長(zhǎng)、療效好的生長(zhǎng)抑素類似物(somatostatin analogue，SSTA)及激動(dòng)劑，首先要構(gòu)建穩(wěn)定可靠的細(xì)胞模型。

SST發(fā)揮作用需要靶向于生長(zhǎng)抑素受體(somatostatin receptors，SSTRs)，該類受體屬于G蛋白偶聯(lián)型受體，共含有5種亞型，分別為SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4以及SSTR5[5]。相對(duì)于該受體家族的其它成員，SSTR2分布最廣，與疾病聯(lián)系最為緊密[6]。因此本研究選擇以SSTR2為靶點(diǎn)，構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞篩選模型。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為一種第二信使，通過調(diào)整其濃度升高或降低在多種信號(hào)通路中發(fā)揮作用。鈣流檢測(cè)原理為熒光指示劑Fluo-4/AM為酯化形式，與活細(xì)胞孵育一段時(shí)間后可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的酯酶會(huì)將其水解成游離酸形式，從而與胞內(nèi)的Ca2+相互作用，在一定波長(zhǎng)下可以檢測(cè)到熒光信號(hào)的變化[7]。當(dāng)SSTRs被激活后會(huì)與抑制型G蛋白( Gi )相偶聯(lián)，從而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升。本研究旨在構(gòu)建SSTR2穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為該受體激動(dòng)劑或SSTA的篩選奠定模型基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料pENTER-SSTR2購自美國Vigenebio公司；載體pEGFP-N3以及HEK293細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR酶購自日本TOYOBO公司；XhoI、BamHI以及T4 DNA連接酶購自美國Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo 2000、鈣離子指示劑Fluo-4/AM購自美國Invitrogen公司；G418粉末購自中國浩瑪公司；HBSS購自美國HyClone公司；pluronic F-127、Probenecid購自中國美倫公司；BSA購自中國翔博生物公司；96孔黑壁底透板購自美國Costar公司； GAPDH抗體(6004-1-lg)購自美國Proteintech公司；GFP抗體(sc-9996)購自中國Santa Cruz公司；思他寧制劑購自瑞士Merck公司；Flex Station 3多功能酶標(biāo)儀工作站購自美國Molecular Devices公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Azure公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建[8]根據(jù)載體pEGFP-N3及SSTR2目的基因序列信息設(shè)計(jì)引物，F(xiàn): 5′-CCGCTCGAGCTATGGACATGGCGGATGAGCCA-3′ (XhoI) ; R: 5′-CGGGATCCGATACTGGTTTGGAGGTCTC-3′ (BamHI)。以pENTER-SSTR2作為模板，按照KOD酶說明書操作，PCR擴(kuò)增獲得約1.1 kb的目的片段，用膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行回收。將回收后的目的片段與載體pEGFP-N3用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA連接酶連接。最后用DH5a感受態(tài)細(xì)胞對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的菌板置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜。次日，挑取3個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR。選取陽性克隆搖菌提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并送公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與人源SSTR2序列比對(duì)。獲得的重組質(zhì)粒命名為SSTR2-pEGFP-N3。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及觀察將HEK293細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞在貼壁12～24 h后密度占0.60～0.80。將SSTR2-pEGFP-N3重組質(zhì)粒以及空白質(zhì)粒pEGFP-N3按Lipo2000試劑說明書步驟分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6 h后更換為無雙抗的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，使用熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光，對(duì)比兩組細(xì)胞綠色熒光的分布。

1.4 mRNA水平驗(yàn)證提取實(shí)驗(yàn)組SSTR2-GFP-HEK293與對(duì)照組pEGFP-N3-HEK293兩組細(xì)胞的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)qPCR引物：GAPDH-F: 5′-ACCCACTCCTCCAC CTTTGA-3′, R: 5′-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3′; SSTR2-F: 5′-TGGCTATCCATTCCATTTGACC-3′, R: 5′-AGGACTGCATTGCTTGTCAGG-3′。取適量cDNA加入SYBR Green Mix及引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得Cp值計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中SSTR2的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。

1.5 Western-blot驗(yàn)證將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞分別接種于35 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，倒棄培養(yǎng)基，加入細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞置于冰上裂解30 min。離心取蛋白上清，使用BCA試劑盒定量，兩組蛋白樣品均為20 μg，沸水浴5 min使蛋白變性。采用70 V、30 min濃縮，120 V、60 min分離的條件進(jìn)行電泳，230 mA、90 min的條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)完牛奶室溫封閉1 h，并于4 ℃環(huán)境中過夜孵育一抗GAPDH及GFP。用TBST清洗3次，洗完后的PVDF膜室溫孵育對(duì)應(yīng)二抗1 h，TBST清洗后用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影曝光，對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選將鑒定成功的SSTR2-GFP-HEK293細(xì)胞用1 g·L-1的G418篩選。篩選一周之后，用胰酶消化細(xì)胞，取少量細(xì)胞種于96孔板的A1孔中，使細(xì)胞數(shù)量大致在4 000～5 000個(gè)。對(duì)A1孔中的細(xì)胞進(jìn)行橫豎梯度稀釋，使單克隆細(xì)胞集中分布于96孔板的右下方部位。種好的96孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩個(gè)星期左右，期間3～5 d換一次液。待單克隆長(zhǎng)成較大的集落，于熒光顯微鏡下挑取帶綠色熒光的克隆，即陽性克隆。陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得SSTR2過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，命名為SSTR2-GFP-HEK293。

1.7 鈣流檢測(cè)體系的建立取適量SSTR2-GFP-HEK293細(xì)胞種于96孔黑壁底透的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁24 h后，開始鈣流檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[9-10]，首先配制鈣流檢測(cè)工作液：2 μmol·L-1的Fluo-4/AM、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05% 的Pluronic F-127、2.5 mmol·L-1Probenecid、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的 BSA，溶劑為含鈣鎂不含酚紅的HBSS。用預(yù)熱至37 ℃含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% BSA的HBSS溶液清洗細(xì)胞兩次。清洗后，每孔加入50 μL的鈣流檢測(cè)工作液，于培養(yǎng)箱中孵育40 min。用相同的HBSS溶液清洗細(xì)胞，至少1次。洗后每孔加入160 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% BSA的HBSS溶液，于培養(yǎng)箱中放置10 min。為了驗(yàn)證鈣流檢測(cè)體系的可行性，使用陽性藥離子霉素(Ionomycin)，配制成20 μmol·L-1的母液(5×)，用Flex station 3檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下的熒光。

1.8 檢測(cè)條件的優(yōu)化在確定檢測(cè)體系可行性以及構(gòu)建的SSTR2-GFP-HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在生長(zhǎng)抑素制劑思他寧的刺激下會(huì)產(chǎn)生特異性鈣流信號(hào)變化后，為了獲得較高的信號(hào)窗口(ΔRFU)以及相對(duì)經(jīng)濟(jì)適宜的篩選條件，本研究對(duì)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、熒光指示劑濃度、以及指示劑的孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。在40 μmol·L-1生長(zhǎng)抑素制劑思他寧的作用下對(duì)比每孔10 000～50 000個(gè)細(xì)胞，熒光指示劑濃度為2～5 μmol·L-1，指示劑孵育時(shí)間分別為30、45、60、75、90、105 min相應(yīng)條件下ΔRFU的變化。在最適條件下對(duì)3個(gè)不同批次SSTR2激動(dòng)劑思他寧進(jìn)行EC50檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism 5軟件。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鈣流信號(hào)ΔRFU采用兩組間t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，EC50值通過非線性擬合獲得。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔, ΔRFU為鈣流信號(hào)最大值與前20 s儀器加樣前基線平均值的差值。Stimulation/%=(ΔRFU-ΔRFUmin)/(ΔRFUmax-ΔRFUmin) ×100%

2 結(jié)果

2.1 SSTR2-pEGFP-N3質(zhì)粒的鑒定由PCR擴(kuò)增獲得1.1 kb的SSTR2目的條帶(Fig 1A)，挑取3個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示3個(gè)為陽性克隆(Fig 1B)。選取其中1號(hào)克隆搖菌提質(zhì)粒，并用XhoI、BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切獲得全長(zhǎng)質(zhì)粒(5.8 kb)、載體(4.7 kb)以及SSTR2基因(1.1 kb)的目的條帶，符合對(duì)應(yīng)片段大小(Fig 1C)。雙酶切鑒定成功的質(zhì)粒測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)，測(cè)序結(jié)果顯示與NCBI上SSTR2的目的序列完全匹配。

Fig 1 Construction and identification of recombinant plasmids SSTR2-pEGFP-N3

A: The fragment of SSTR2 was amplified by PCR from the template of pENTER-SSTR2; B: The positive plasmids with SSTR2 were identified using colony PCR; C: The recombinant plasmid was identified by double digestion of XhoI and BamHI.

2.2 SSTR2-GFP-HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒SSTR2-pEGFP-N3以及對(duì)照組pEGFP-N3質(zhì)粒24 h后的HEK293細(xì)胞。過表達(dá)SSTR2的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的綠色熒光在細(xì)胞膜上均勻分布，符合該受體的分布情況，而對(duì)照組細(xì)胞的綠色熒光則分散于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中(Fig 2A)。Western blot結(jié)果顯示SSTR2-GFP-HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞成功表達(dá)了SSTR2與GFP標(biāo)簽的融合蛋白(Fig 2B)。qPCR結(jié)果也顯示相比于對(duì)照組，在SSTR2-GFP-HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中SSTR2基因mRNA水平明顯上調(diào)，進(jìn)一步表明該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株成功表達(dá)了SSTR2基因。

2.3 鈣流檢測(cè)模型的建立基于文獻(xiàn)調(diào)研，初步建立了鈣流篩選體系。為驗(yàn)證該體系的可行性，使用了陽性藥離子霉素(Ionomycin)。離子霉素是一種離子載體，對(duì)Ca2+有很好的親和力，不僅可以使其從胞外進(jìn)入胞內(nèi)，還能促進(jìn)其從胞內(nèi)的庫釋放到細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明離子霉素可以顯著的升高細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)值，而溶劑對(duì)照組則幾乎沒有鈣流信號(hào)的變化(Fig 3A)，表明該體系能有效地檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的鈣流信號(hào)變化。在確定體系可行性后，對(duì)SSTR2-GFP-HEK293細(xì)胞模型有效性進(jìn)行鑒定。在離子霉素驗(yàn)證后的體系，將刺激藥物換成SSTR2受體激動(dòng)劑生長(zhǎng)抑素制劑，以pEGFP-N3-HEK293細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在思他寧的刺激下會(huì)產(chǎn)生濃度依賴性的鈣流信號(hào)增加，而對(duì)照組則未出現(xiàn)鈣流信號(hào)變化(Fig 3B)。

Fig 2 Identification of stable cell lines

2.4 鈣流檢測(cè)體系的優(yōu)化將鈣流信號(hào)以ΔRFU表示，結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞個(gè)數(shù)為30 000/孔時(shí)ΔRFU值與本底有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，所以最終確定每孔30 000個(gè)細(xì)胞運(yùn)用于接下來的檢測(cè)體系中(Fig 3C)。在對(duì)熒光指示劑Fluo-4/AM濃度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)ΔRFU隨著指示劑的濃度增加而增加。為了獲得相對(duì)較大的ΔRFU值，以及考慮到后期做大量篩選的成本問題，選用了3 μmol·L-1的Fluo-4/AM作為后期篩選的工作濃度(Fig 3D)。優(yōu)化熒光指示劑孵育時(shí)間結(jié)果顯示，當(dāng)孵育45 min時(shí)，ΔRFU顯著增加(P<0.01)，就算進(jìn)一步延長(zhǎng)孵育時(shí)間也不能更有效的提高ΔRFU，為了后期篩選工作的高效及迅速，確定熒光指示劑的孵育時(shí)間為45 min(Fig 3E)。

2.5 SSTR2-GFP-HEK293細(xì)胞篩選模型的應(yīng)用對(duì)3個(gè)批次(批號(hào)分別為AU021084、AU022158、AU020854)的生長(zhǎng)抑素制劑思他寧進(jìn)行檢測(cè)，EC50值分別為51.37 pmol·L-1、81.14 pmol·L-1、56.80 pmol·L-1(Fig 3F)。結(jié)果表明，不同批次的思他寧EC50值接近，符合已上市藥生產(chǎn)規(guī)范，同時(shí)也表明該檢測(cè)體系的穩(wěn)定有效性。

3 討論

SST及SSTA已被臨床應(yīng)用于治療多種人類疾病，如促腎上腺皮質(zhì)激素過量引起的庫欣綜合征，生長(zhǎng)激素過度釋放導(dǎo)致的肢端肥大癥，以及消化道出血等。研究表明相對(duì)于該受體家族的其它成員，SSTR2的分布最為廣泛，尤其是在一些腫瘤組織中[3]。SSTR2與癌癥治療相關(guān)的研究逐年增加，該受體在多種癌細(xì)胞及腫瘤血管中異常表達(dá)[11-12]。當(dāng)體內(nèi)受體被激活時(shí)會(huì)產(chǎn)生抑制激素分泌和細(xì)胞增殖的效應(yīng)，該效應(yīng)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。SSTA目前已被開發(fā)為抗腫瘤的輔助藥物，部分長(zhǎng)效制劑甚至直接發(fā)揮抗腫瘤作用，如奧曲肽[13]。開發(fā)作用時(shí)間長(zhǎng)、療效好的SSTRs激動(dòng)劑和SSTA，不僅為消化道出血、急性胰腺炎以及肢端肥大癥等疾病提供更多的用藥選擇，同時(shí)也可作為癌癥治療的一種新策略。本研究選擇建立靶向于SSTR2的體外篩選模型，便于篩選出特異性靶向該受體的激動(dòng)劑及類似物。

Fig 3 Optimization and application of calcium flow detection system

配體與受體的結(jié)合會(huì)使體內(nèi)的第二信使產(chǎn)生一系列的生理變化，常見的第二信使有cAMP、cGMP、Ca2+等。本研究前期有檢測(cè)過cGMP的信號(hào)變化，發(fā)現(xiàn)該模型在生長(zhǎng)抑素制劑思他寧的作用下，cGMP的信號(hào)難以檢測(cè)到。對(duì)比通過鈣流的方式檢測(cè)體內(nèi)Ca2+的信號(hào)變化，鈣流檢測(cè)方法更為敏感，易于檢測(cè)。

本研究建立的細(xì)胞篩選模型，從檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量、熒光指示劑的濃度，以及指示劑孵育的時(shí)間等方面對(duì)鈣流檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化。確定30 000個(gè)細(xì)胞每孔，F(xiàn)luo-4/AM指示劑濃度為3 μmol·L-1，孵育時(shí)間為45 min相對(duì)適宜的檢測(cè)條件，為后續(xù)該篩選模型的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

以SSTR2為靶點(diǎn)的篩選模型的建立，不僅可以為尋找新的SSTR2激動(dòng)劑及SSTA提供有效的方法，同時(shí)也適用于新藥研發(fā)過程中對(duì)未上市藥進(jìn)行體外藥效評(píng)估及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)藥學(xué)院的新藥成藥性評(píng)估與評(píng)價(jià)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)給予實(shí)驗(yàn)幫助的老師和同學(xué)表示感謝。)