楊明浩， 葛曼玲， 付曉璇， 黃賢沖， 崔家俊， 郭志彤， 張夫一

(河北工業(yè)大學(xué)電氣工程學(xué)院， 省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北省電磁場與電器可靠性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300130)

癲癇(epilepsy)是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。發(fā)作間期活動(dòng)(interictal-like activity, ILA)是癲癇發(fā)展過程(epileptogenesis)的重要特征，與神經(jīng)回路有關(guān)[2，3]。在顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy, TLE)的實(shí)驗(yàn)大鼠模型中，ILA多出現(xiàn)在早期階段[3-5]，這表明致癲癇網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建直接與ILA有關(guān)[6]，同時(shí)ILA可用來預(yù)測癲癇的發(fā)展[7]。ILA的反致癇作用也被提出[8，9]。一般來說，ILA與谷氨酸回路、GABA能回路以及兩種回路之間的不平衡有關(guān)[2]。ILA與各種類型癲癇中抑制性GABA能神經(jīng)元的興奮性和動(dòng)作電位放電選擇性喪失也有關(guān)[10]，ILA傳導(dǎo)還隨GABA能所介導(dǎo)的抑制作用不同而有所差異[10，11]。此外，癲癇中具有重要特征的病態(tài)信號散發(fā)性尖波(sporadic spikes, SSs)是由海馬CA1區(qū)在癲癇發(fā)生過程中興奮性和抑制性突觸間的不平衡所造成[11]。對動(dòng)物模型和癲癇患者的研究表明：ILA可打斷認(rèn)知節(jié)律，如內(nèi)側(cè)顳葉(MTL)中的theta節(jié)律。

theta振蕩作為哺乳動(dòng)物腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)里最主要的神經(jīng)元同步化活動(dòng)的一種，是空間導(dǎo)航和定位、學(xué)習(xí)、記憶的重要信號頻率，也是研究認(rèn)知和顳葉癲癇作用機(jī)制的關(guān)鍵信號之一。海馬結(jié)構(gòu)系大腦半球皮質(zhì)內(nèi)側(cè)緣的部分，屬于古老皮質(zhì)，海馬CA1區(qū)的功能主要與空間記憶有關(guān)。嗅行時(shí)大鼠的海馬CA1區(qū)含有豐富的theta節(jié)律，此外，theta節(jié)律的斷裂可能與海馬區(qū)主要神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的消亡有關(guān)[12-16]，從而造成顳葉癲癇患者(TLE)的認(rèn)知缺陷，如空間記憶和工作記憶等障礙[12，14]。

前期，我們在匹羅卡品(pilocarpine)致癇嗅行大鼠模型上，應(yīng)用腦深度電極記錄(SEEG)研究了海馬CA1區(qū)ILA對theta節(jié)律的瞬時(shí)抑制作用，發(fā)現(xiàn)：ILA在早期對theta能量和相位穩(wěn)定性損傷最為嚴(yán)重。SSs是ILA的一種形式，以相鄰尖波之間(尖波間期)持續(xù)時(shí)間較長、并在尖波期后伴隨較長時(shí)間無尖波恢復(fù)期為特征，常用來研究癲癇尖波與認(rèn)知狀態(tài)、癲癇波形態(tài)和癲癇發(fā)生過程等因素對腦功能的影響[15]。最近，我們通過時(shí)頻分析的量化評估技術(shù)，對處于安靜休息狀態(tài)的4位TLE患者立體定向腦電(SEEG)的發(fā)散性尖波在海馬區(qū)CA3和嗅皮層EC腦區(qū)的theta節(jié)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)：尖波對theta能量有瞬態(tài)的削減作用，并且，尖波間期theta節(jié)律的斷裂與這種削減作用成正比[17]。Theta斷裂自1978年由Winson在大鼠模型上發(fā)現(xiàn)并發(fā)表在Science上以來[14]，一直沒能很好地開展下去，癲癇尖波何時(shí)打斷theta節(jié)律以及癲癇發(fā)展進(jìn)程中theta節(jié)律斷裂的規(guī)律是什么等問題尚沒有很好地解決，主要原因是缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。借鑒立體定向腦電技術(shù)，本文使用了癲癇發(fā)展進(jìn)程中匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，在尖波間期和無尖波恢復(fù)期分別研究了癲癇早期和晚期theta節(jié)律斷裂的規(guī)律。本文為癲癇對認(rèn)知節(jié)律的抑制作用提供了分析依據(jù)，對揭示癲癇與認(rèn)知的關(guān)系具有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

法國馬賽地中海大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究室提供了顳葉癲癇大鼠模型的相關(guān)信息和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

14只成年Wistar大鼠，均為雄性，體質(zhì)量(225±20)g。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(20±3) ℃，相對濕度40%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)的分組與處理

將大鼠在麻醉狀態(tài)時(shí)進(jìn)行開顱手術(shù)，將1只直徑約為 0.8 mm的雙極性鋼電極埋入海馬區(qū)的背側(cè)，在大鼠顱骨上，將3個(gè)不銹鋼皮質(zhì)電極植入，在其右額皮質(zhì)和左額皮質(zhì)，分別將兩只電極植入。小腦埋入?yún)⒖茧姌O，隨后將顱骨粘合，檢測、記錄大鼠腦電圖；之后腹腔注射癲癇誘發(fā)藥物：匹羅卡品氫氯化物(pilocarpine hydrochloride,310 mg/kg)、30 min后注射大鼠莨菪堿 (scopolamine, 1 mg/kg)。詳細(xì)手術(shù)過程見 Chauviere 等[13]。當(dāng)首次在與腦電同步的視頻監(jiān)視儀上觀察到大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài) (status epilepticus, SE)時(shí)，同時(shí)在EEG(DeltamedTM)上觀察到持續(xù)的高振幅放電，40 min 后注射安定；癲癇發(fā)生早期大多出現(xiàn)在癲癇持續(xù)狀態(tài)后4～10 d，通過在視頻監(jiān)視儀上觀察大鼠行為同時(shí)在EEG上觀察大鼠腦電圖，發(fā)現(xiàn)發(fā)作間期活動(dòng) (interictal-like activity, ILA) 在7 d后才正式建立起來，本文定義7 d(7D)為癲癇發(fā)展進(jìn)程的早期。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后14～16 d，大鼠又一次出現(xiàn)自發(fā)放電，此時(shí)EEG為發(fā)作間期活動(dòng) (interictal activity, IA)，對應(yīng)于癲癇持續(xù)狀態(tài)后25～40 d為癲癇發(fā)展進(jìn)程的晚期，本文取25 d(25D)。其中研究7 d的大鼠有6只，25 d的大鼠有5只，注射前(BI)和7 d，25 d無尖波恢復(fù)期的大鼠均是3只。所有分析以1 h數(shù)據(jù)為一個(gè)記錄段。因?yàn)樵谠缙?，ILA放電不頻繁，一天中在每只大鼠上至少取2個(gè)記錄段用于計(jì)算。但在晚期，ILA放電頻繁，一天中在每只大鼠上取 1 個(gè)記錄段用于計(jì)算?？傊?，保證在每只大鼠上所取的記錄段總數(shù)比較均勻，即每只大鼠尖波總數(shù)至少大于30段。D7在6只大鼠腦電上取了224個(gè)尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時(shí)間分別是14.21和3.7 s；D25在5只大鼠腦電上取了290個(gè)尖波，尖波間期持續(xù)的最長和最短時(shí)間分別是12.89 s和3.56 s。尖波腦電后有較長時(shí)間的無尖波恢復(fù)期，尖波腦電后2 h后取一個(gè)記錄段。文章的記錄段皆為白天，無夜間睡眠節(jié)律的影響。D7在3只大鼠上取恢復(fù)期腦電，最長和最短計(jì)算時(shí)間分別是20.37 s和5.14 s；D25也在3只大鼠上取恢復(fù)期腦電，最長和最短計(jì)算時(shí)間分別是18.65 s和4.96 s。最后需要說明的是，注射前在3只大鼠取腦電，最長和最短計(jì)算時(shí)間分別是35.38 s和7.69 s。

1.3 大鼠腦電極植入的方法與腦電圖的觀察

Gabor小波變換能夠較好地兼顧信號在時(shí)域和頻域中的分辨率，可獲取theta節(jié)律的時(shí)頻能量，并可直接觀察theta節(jié)律是否具有時(shí)間連續(xù)性。Gabor小波變換可用下式描述：

(1)

公式中，復(fù)數(shù)Wx(t0,f)代表信號x(t)在頻率為f時(shí)間為t0時(shí)刻的正交信息，η代表中心頻率，復(fù)數(shù)Wx(t0,f)實(shí)部和虛部的平方和為小波能量值。選取3.5 s計(jì)算時(shí)長，選取的時(shí)長和之前的研究一致[15、17]，可獲得Gabor小波時(shí)頻能量。當(dāng)進(jìn)行能量分析時(shí)，小波能量對段平均，可直接觀察theta能量在尖波附近的動(dòng)態(tài)變化。在時(shí)頻分析圖中，當(dāng)能量突然消失或變得很低，成為背景顏色時(shí)，當(dāng)背景顏色持續(xù)時(shí)間達(dá)到200 ms及以上時(shí)認(rèn)為該段(以350 ms為一段)節(jié)律出現(xiàn)斷裂，選取的時(shí)長和之前在癲癇尖波附近350 ms的研究一致[15，17]。計(jì)算斷裂的段數(shù)與總段數(shù)的比值，定義為theta節(jié)律斷裂比，用來衡量尖波間期或無尖波恢復(fù)期theta節(jié)律斷裂程度。本文以t檢驗(yàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

沒有偽差的腦電圖中，尖波幅值要高于內(nèi)在 EEG (intrinsic EEG) 幅值的10倍以上。為獲取內(nèi)在腦活動(dòng)，需要去除尖波的作用，尖波的開始和結(jié)束由起始點(diǎn)(onset)和終止點(diǎn)(offset)由經(jīng)驗(yàn)豐富的法國神經(jīng)學(xué)專家根據(jù)EEG上癲癇尖波前后基線 (baseline) 來確定。在尖波間期，我們選取D7和D25的每只大鼠的前一個(gè)尖波的offset到后一個(gè)尖波的onset的時(shí)間序列；在注射前和無尖波恢復(fù)期，我們遍歷了每只大鼠嗅行時(shí)腦電的時(shí)間序列，如圖1所示。值得說明的是那些幅度較小的尖波(如圖1C所示)也會(huì)對theta節(jié)律斷裂分析造成影響需要去除：在腦電分析軟件EEGLAB中找到小尖波對應(yīng)的時(shí)間刻度，換算成在小波時(shí)頻能量對應(yīng)的時(shí)間刻度，在進(jìn)行能量分析時(shí)，去除該時(shí)間段，就可以去除這個(gè)小尖波的影響。文章所用段數(shù)歸納如下(表1)：在尖波間期，D7一共419段，發(fā)生斷裂數(shù)是126段；D25一共3729段，發(fā)生斷裂數(shù)是906段；注射前一共1290段，發(fā)生斷裂數(shù)是75；在無尖波恢復(fù)期，D7一共420段，發(fā)生斷裂數(shù)是98段；D25一共270段，發(fā)生斷裂數(shù)是61段。

2 結(jié)果

2.1 尖波間期theta節(jié)律斷裂

D7的尖波間期的波形圖和對應(yīng)的theta節(jié)律時(shí)頻能量圖如圖所示(圖2A上)，與注射前相比，此期間的theta節(jié)律能量斷裂比相較于注射前增加了近6倍，如表格1所示。而D25(圖2A下)，盡管與注射前相比，theta節(jié)律仍然有很大的斷裂程度，但是相對于D7來說，斷裂程度趨緩，斷裂比降低了6%左右(表1)。此外，尖波間期發(fā)生較大程度的theta節(jié)律斷裂表明尖波是導(dǎo)致theta節(jié)律斷裂的直接原因。

Fig.1EEG during epileptogenesis

A: Period between two adjacent spikes; B: Before-injections(BI) period and recovery period without spikes; C: EEG connotative a tiny spike(between two gray lines)

2.2 無尖波恢復(fù)期theta節(jié)律斷裂

注射前腦電波形和theta節(jié)律時(shí)頻能量表現(xiàn)為能量連續(xù)和良好的質(zhì)量，發(fā)生斷裂的段數(shù)比較少，斷裂情形微乎其微，如圖所示(圖2B上)，反映出健康大鼠theta節(jié)律呈現(xiàn)良好狀態(tài)，斷裂比僅5.81%，如表1所示。D7的無尖波恢復(fù)期腦電出現(xiàn)較大比例的theta節(jié)律斷裂(圖2C上)，斷裂比高達(dá) 27.14%，與D7的尖波間期相當(dāng)。

D25的無尖波恢復(fù)期的斷裂程度(圖2C下)卻較D7有所降低(22.59%)，如表1所示，但與D25的尖波間期相當(dāng)。

3 討論

本文分析了顳葉癲癇大鼠在尖波間期和無尖波恢復(fù)期theta節(jié)律斷裂在癲癇發(fā)展進(jìn)程中的規(guī)律，得出如下結(jié)論：(1)癲癇尖波是theta節(jié)律斷裂的直接原因；(2)即便是在無尖波恢復(fù)期，theta節(jié)律斷裂仍然持續(xù)。

Fig.2Examples of theta rhythms continuity and breakage in EEG and time-frequency plane during each period

A: Period between two adjacent spikes on day 7 and day 25; B: Before injections; C: Recovery period without spikes

Tab.1The numbers of disrupted theta rhythms and breakage ratio(%) in different periods

Before injectionsInterspike periodRecovery period without spikesD7D25D7D25Loss7512690611461Breakage ratio(%)5.8130.7024.3027.1422.59

在癲癇網(wǎng)絡(luò)中，突觸驅(qū)動(dòng)的不平衡是產(chǎn)生癲癇尖波的主要原因，它使得網(wǎng)絡(luò)易于產(chǎn)生癲癇發(fā)作，并便于癲癇波的傳導(dǎo)[3]，以持續(xù)增強(qiáng)的興奮性或持續(xù)降低的抑制性為特征的網(wǎng)絡(luò)超興奮 (hyper-excitation)狀態(tài)是這種不平衡作用的主要結(jié)果。尖波間期theta節(jié)律的斷裂很可能與這種不平衡所產(chǎn)生的影響有關(guān)。在D7，尖波對慢GABA能神經(jīng)元的抑制性造成很大的傷害[3]，致使GABA能網(wǎng)絡(luò)交互性大大降低，導(dǎo)致theta節(jié)律斷裂比很大。相反，在D25，谷氨酸突觸調(diào)制作用有所增強(qiáng)[3，18]，即興奮性有所增強(qiáng)，因此，斷裂比相對D7有所減小。本文揭示的早期theta節(jié)律斷裂最為嚴(yán)重的分析結(jié)果與Chauvièha等發(fā)現(xiàn)的癲癇早期大鼠對空間位置記憶功能受傷害最大有關(guān)聯(lián)[13]，也與我們前期在尖波附近瞬態(tài)(350 ms)分析得出的規(guī)律是一致的[15，16]。此外，研究表明：嗅行速度和焦慮情緒等因素會(huì)影響theta節(jié)律，Chauvièha等研究說明了癲癇發(fā)生晚期比早期嗅行速度要低，與本文分析的theta節(jié)律的斷裂趨勢一致，但在注射前大鼠嗅行速度更低，而本文分析的theta節(jié)律斷裂較少，具有良好的質(zhì)量，因此，嗅行速度和焦慮情緒不是導(dǎo)致theta節(jié)律斷裂的直接因素，癲癇形成了CA1神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)超同步是主要原因。本文研究結(jié)論和癲癇導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷會(huì)導(dǎo)致海馬theta節(jié)律能量降低直至斷裂的結(jié)論是一致的[10，11]。文章所取無尖波期為發(fā)散尖波停止出現(xiàn)后的一段1 h腦電，在這1 h時(shí)間內(nèi)不僅沒有尖波發(fā)放，也沒有bursts發(fā)放，更沒有seizures，我們斷定該無尖波期theta節(jié)律的斷裂由前面的尖波引起。無尖波恢復(fù)期theta節(jié)律斷裂與尖波間期相當(dāng)，可能與癲癇導(dǎo)致CA1網(wǎng)絡(luò)重組有關(guān)[19]，盡管此期間沒有尖波，但重組了的CA1網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)無法恢復(fù)，導(dǎo)致theta節(jié)律的損傷持續(xù)。今后的工作將在虛擬腦模型上用理論方法研究theta節(jié)律斷裂的深層機(jī)制。