華曉東，侯 娟，徐 琳，稅鳳春

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

血小板功能檢測(cè)最經(jīng)典的方法是血小板聚集試驗(yàn)，由于該方法需要制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)，影響因素較多，試驗(yàn)者的操作經(jīng)驗(yàn)對(duì)結(jié)果的影響較大，因此試驗(yàn)的可靠性較差。CD62p又名血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白，是血小板活化的特異性生物標(biāo)志物。降低血小板的CD62p表達(dá)是臨床活血化瘀方劑抗血小板治療效果監(jiān)測(cè)的高特異性指標(biāo)，與其臨床效應(yīng)密切相關(guān)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD62p的表達(dá)，進(jìn)而評(píng)價(jià)血小板的功能[1],方法快速穩(wěn)定，簡(jiǎn)單可靠，影響因素少，靈敏度也高于血小板聚集試驗(yàn)。本研究擬通過(guò)比較這兩種血小板功能的評(píng)價(jià)方法，為在臨床前研究中綜合評(píng)價(jià)血小板功能提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1藥品 注射用丹參多酚酸：淺棕色疏松塊狀物， 規(guī)格：100 mg/支，批號(hào)20180501，試驗(yàn)時(shí)分別采用氯化鈉注射液按丹參多酚酸含量計(jì)算稀釋至試驗(yàn)所需濃度備用。單抗 anti-mouse/rat CD62p-PE/Cy7(藻紅蛋白-青花素7標(biāo)記的抗大/小鼠CD62p抗體，批號(hào)B223759)、anti-mouse/rat CD61-PE(藻紅蛋白標(biāo)記的抗大/小鼠CD61抗體，批號(hào)B216420)，均由美國(guó)Biolegend公司生產(chǎn)；同型對(duì)照 Rat IgG2a-PE/Cy7(藻紅蛋白-青花素7標(biāo)記的大鼠IgG2a，批號(hào)4290714)、Rat IgG-PE(藻紅蛋白標(biāo)記的大鼠IgG，批號(hào) 4281135)，美國(guó)eBioscience公司生產(chǎn)。ADP(批號(hào)SLBP6247V，SIGMA公司生產(chǎn))。

1.2儀器 ACEA流式細(xì)胞儀，ACEA Bioscience,Inc；LBY-NJ4血小板聚集儀，北京生化儀器廠生產(chǎn)；XS-205DU電子天平，精度0.1 mg，試劑稱量用；XP2001S電子天平，精度1 g，動(dòng)物稱量用。

1.3動(dòng)物 SD大鼠，體重 220～250 g，雌雄各半，雌鼠應(yīng)無(wú)孕，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2016-0002。

1.4方法

1.4.1注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠體外血小板聚集功能的影響 取SD大鼠8只，雌雄各半，體重230～250 g，大鼠腹腔注射20%烏拉坦5 ml/kg麻醉。以注射器自大鼠腹主動(dòng)脈采血，每只約5～6 ml，置硅化離心管中，以3.2%檸檬酸鈉溶液9∶1抗凝，1 000 r/min離心5 min，制成富血小板血漿(PRP)，以2 000 r/min離心10 min，制成貧血小板血漿(PPP)，按比濁法采用血小板聚集儀測(cè)定血小板的最大聚集率。注射用丹參多酚酸配制成不同濃度(4、1、0.4、0.1和0.04 mg/ml)，將對(duì)照管取0.18 ml PPP加入0.02 ml氯化鈉注射液校正100%透過(guò)率值，每個(gè)測(cè)定管取0.18 ml PRP加入0.02 ml氯化鈉注射液(基礎(chǔ)值)或不同濃度的藥液，預(yù)先將測(cè)定管在血小板聚集儀中溫育5 min，再加入 200 μmol ADP溶液10 μl(終濃度為10 μmol/ml)，隨即記錄5 min內(nèi)血小板最大聚集率，對(duì)照組與各給藥組平行檢測(cè)。以各組的血小板最大聚集率進(jìn)行組間比較(t測(cè)驗(yàn))，并計(jì)算出血小板聚集抑制率。采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，受試物作用前后進(jìn)行配對(duì)資料的t檢驗(yàn)。血小板聚集抑制率(%)=(對(duì)照組聚集率-給藥組聚集率)/對(duì)照組聚集率。

1.4.2注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠體外血小板活化的影響 上述大鼠麻醉后眼眶取血0.5 ml，以3.2%檸檬酸鈉溶液9∶1抗凝。每只動(dòng)物取1份50 μl抗凝血加入氯化鈉注射液50 μl，37 ℃作用5 min，加入50 μl終濃度為10 μmol的ADP激活，用于測(cè)定經(jīng)ADP激活血小板活化率基礎(chǔ)值；另分別取50 μl抗凝血加入不同濃度(4、1、0.4、0.1和0.04 mg/ml)的丹參多酚酸溶液50 μl，37 ℃作用5 min，再用終濃度為10 μmol的ADP激活。上述2種抗凝血分別加入CD62p PE/Cy7和CD61 PE各1.0～1.5 μl雙標(biāo)，以CD61標(biāo)記所有血小板，CD62p標(biāo)記活化血小板。以上各管4 ℃避光孵育20 min；再加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定10 min。取固定后的血樣50 μl，加入1 ml稀釋液稀釋后上機(jī)分析。在CD61 PE/側(cè)向角光散射(SSC)雙參數(shù)散點(diǎn)圖中劃定血小板細(xì)胞群，計(jì)數(shù)5 000個(gè)血小板，進(jìn)一步在CD61/CD62p散點(diǎn)圖中計(jì)數(shù)CD61及CD62p陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，并以CD62p陽(yáng)性表達(dá)率占CD61表達(dá)率的百分比反映血小板的活化率(%)。處理后上機(jī)檢測(cè)與受試物作用后經(jīng)ADP激活的血小板活化率。并采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，受試物作用前后進(jìn)行配對(duì)資料的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1對(duì)大鼠體外血小板聚集功能的影響 在采用血小板聚集儀進(jìn)行的血小板聚集檢測(cè)中，0.4 mg/ml以上的丹參多酚酸能夠明顯抑制血小板的聚集作用。而0.1 mg/ml劑量已無(wú)明顯的血小板聚集抑制作用。由于每只動(dòng)物的采血量不足以支持全部的檢測(cè)樣本，因此未進(jìn)行0.1 mg/ml以下劑量的檢測(cè)。見(jiàn)表1。

表1 注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠體外血小板聚集作用的影響

2.2對(duì)大鼠體外血小板活化的影響 在采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的血小板活化檢測(cè)中，0.04 mg/ml以上的丹參多酚酸均可明顯抑制CD62p的表達(dá)，對(duì)血小板表現(xiàn)出明顯的活化抑制作用。見(jiàn)表2。

2.3方法一致性的比較 不同濃度藥物對(duì)血小板聚集抑制率與血小板活化抑制率的相關(guān)分析，給藥后不同濃度藥物對(duì)血小板聚集抑制率與血小板膜糖蛋白CD62p活化抑制率均成正相關(guān)，按抑制率計(jì)算，兩種方法的相關(guān)性為0.982。表明兩種方法有較好的一致性，而血小板活化檢測(cè)的靈敏度明顯高于聚集率檢測(cè)。見(jiàn)圖 1 。

表2 注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠體外血小板活化作用的影響

圖1 丹參多酚酸對(duì)血小板活化抑制率和聚集抑制率影響的比較

3 討論

心肌梗死、腦栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在我國(guó)發(fā)病率很高，活血化瘀是主要的治療手段，活血化瘀藥物應(yīng)用非常廣泛。而評(píng)價(jià)活血化瘀藥物功效的主要手段就是檢測(cè)藥物對(duì)血小板功能的影響。血小板活化、血小板聚集是血栓形成的病理基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)血小板功能的最重要指標(biāo)[2]。

血小板功能的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為比濁法檢測(cè)血小板聚集，即采用血小板聚集儀測(cè)定血小板聚集情況的經(jīng)典方法，該方法應(yīng)用廣泛，是目前較為經(jīng)典的血小板功能檢測(cè)方法，但該方法也存在一些固有的不足。例如去除紅細(xì)胞不能完全反映體內(nèi)血細(xì)胞之間的相互作用；如測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，可致血小板功能降低；需要制備的富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)沒(méi)有嚴(yán)格規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，影響因素較多，個(gè)人操作習(xí)慣對(duì)結(jié)果影響較大，結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差。需要較多的血液量，不適合用于高通量篩選。

CD62p(P-選擇素,GMP-140)又名血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白或P-選擇素,是一種膜糖蛋白顆粒，在靜息血小板中僅分布在血小板內(nèi)部, 當(dāng)血小板被激活時(shí), 隨著血小板脫顆粒與釋放反應(yīng), CD62p 重新分布至血小板膜表面, 且其只能在脫顆粒的血小板表面表達(dá)。由于只在已活化的血小板上有表達(dá)，其表達(dá)程度與血小板活化有很強(qiáng)的相關(guān)性，因而CD62p被認(rèn)為是血小板活化檢測(cè)的高特異性指標(biāo)，與藥物的臨床效應(yīng)密切相關(guān)。臨床研究顯示在冠心病的不同類型患者(穩(wěn)定型心絞痛及急性冠脈綜合征)中均觀察到 CD62p 顯著升高的現(xiàn)象, 即血小板的異?；罨煌瑫r(shí)CD62p水平與冠心病血瘀證呈正相關(guān)，因此降低血小板的 CD62p 表達(dá)也成為臨床活血化瘀方劑抗血小板治療的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一[3，4]。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化時(shí)血小板表面糖蛋白CD62p的表達(dá)，只需取少量外周血，經(jīng)單克隆抗體標(biāo)記后就可快速、穩(wěn)定地檢測(cè)。隨著流式細(xì)胞儀檢測(cè)手段的完善，其檢測(cè)的敏感性和特異性也大大提高。因此，完全可以通過(guò)建立一種相對(duì)簡(jiǎn)單的流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD62p含量或百分率的模型，達(dá)到檢測(cè)抗血小板活化類活血化瘀藥物生物活性的目的。即將一定量的受試物(注射用丹參多酚酸)與大鼠抗凝血混合，作用一定時(shí)間后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生物標(biāo)志物(CD62p)的方法，測(cè)定并比較給藥前后經(jīng)ADP激活的血小板活化率，判定該受試物是否對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板活化具有抑制作用，從而評(píng)價(jià)藥物是否具有活血化瘀作用。與傳統(tǒng)血小板聚集測(cè)定法相比[5，6]，全血法流式細(xì)胞術(shù)(FCM)有許多明顯優(yōu)點(diǎn)，采用全血進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)本處理的簡(jiǎn)化能避免血小板體外激活，并防止血小板影響因子的丟失，不干擾循環(huán)中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞對(duì)血小板活化的影響，因此能在最接近真實(shí)體內(nèi)環(huán)境的條件下測(cè)定血小板功能；由于使用了血小板生物標(biāo)志物(單抗)，檢測(cè)的僅是血小板，而不會(huì)受其他種類細(xì)胞或碎片的干擾，保證了檢測(cè)的特異性；檢測(cè)僅需極少量全血，一次取血可進(jìn)行多批樣品檢測(cè)，可減少動(dòng)物用量，符合動(dòng)物倫理；檢測(cè)速度快，在接收樣品后24 h內(nèi)即可同時(shí)完成多批樣品的檢測(cè)；操作簡(jiǎn)單，影響因素較少，同時(shí)靈敏度高，方法穩(wěn)定可靠，尤其適合進(jìn)行大量樣品的篩選。

注射用丹參多酚酸是一種新型的中藥注射劑，具有明確的活血化瘀功效。在本研究中，不同劑量的丹參多酚酸可以明顯地抑制ADP誘導(dǎo)的血小板活化和血小板聚集，而且采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的血小板活化檢測(cè)的靈敏度明顯高于采用比濁法進(jìn)行的血小板聚集檢測(cè)。由于血小板活化是血小板聚集的必經(jīng)步驟，二者的檢測(cè)結(jié)果有很好的正相關(guān)性，而血小板活化檢測(cè)的諸多優(yōu)點(diǎn)提示該方法可以作為血小板聚集檢測(cè)的替代方法用于血小板的功能評(píng)價(jià)。

中藥成分復(fù)雜，單一地通過(guò)理化檢測(cè)控制少數(shù)指標(biāo)性成分難以全面控制藥物的安全性和有效性，因此利用生物活性測(cè)定法對(duì)于中藥進(jìn)行質(zhì)量控制已是一種必然的趨勢(shì)。相較于影響因素較多的整體試驗(yàn)，通過(guò)選擇一種公認(rèn)的、特異性良好的生物標(biāo)記物作為檢測(cè)指標(biāo)來(lái)反映藥物的生物活性，能夠從作用機(jī)制角度更好地體現(xiàn)其有效性，檢測(cè)指標(biāo)更易量化，也更適合作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)引入具體品種項(xiàng)下。