毛慎 朱雪婷 劉克勤 操小棟 葉永康

摘要[目的]構(gòu)建一種電化學(xué)傳感器，用于水產(chǎn)品中敵草隆的檢測(cè)。[方法]將氨水和肼作為還原劑，通過一步法合成了氯化血紅素功能化的還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料，采用安培響應(yīng)法分析敵草隆在納米復(fù)合材料修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為。[結(jié)果]該傳感器可在磷酸鹽緩沖溶液（ 0.1 mol/L，pH 7.4）中，-0.35 V（ vs.Ag/AgCl）電位下通過電流法檢測(cè)敵草隆含量，線性范圍為6.00×10-12～3.24×?10-10 mol/L，檢測(cè)限低至1.09 ×10-12 mol/L（S/N=3），選擇性令人滿意，并且表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。[結(jié)論]該傳感器可用于確定水產(chǎn)品中敵草隆的存在，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞電化學(xué)傳感器;氯化血紅素;還原氧化石墨烯;敵草隆;安培電流法

中圖分類號(hào)TS?207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0198-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.054

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Detection of Diuron in Aquatic Products Based on Nano-materials Constructed Electrochemical Sensors

MAO Shen， ZHU Xue-ting， LIU Ke-qin et al

（School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective]The research aimed to construct an electrochemical sensor for the detection of diuron in aquatic products.[Method]The hemin-functionalized graphene oxide （Hemin-rGO） composite was synthesized by one-pot method with ammonia solution and hydrazine solution as reducing agents.Electrochemical behavior of diuron on nanocomposite modified glassy carbon electrode was analyzed by amperometric response method. [Result]The sensor was applied in the amperometric determination of diuron at -0.35 V （vs. Ag/AgCl） in a phosphate buffer （ 0. 1 mol/L，pH 7.4）with a linear range from 6.00 × 10-12 mol/L to 3.24 × 10-10 mol/L， detection limit as low as 1.09 × ?10-12 mol/L （S/N=3）. The sensor also showed satisfactory selectivity with good repeatability and stability. [Conclusion]The sensor can be used to determine the presence of diuron in aquatic products and has a good application prospect.

Key wordsElectrochemical sensor;Hemin;Reduced graphene oxide;Diuron;Amperometric current method

由于農(nóng)業(yè)中農(nóng)藥的大量使用，使得中國(guó)的許多水域受到了農(nóng)藥的污染，對(duì)人們的飲食健康造成了巨大的影響。敵草隆是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，接觸身體后會(huì)對(duì)自身的健康產(chǎn)生危害[1]，如腫瘤及增生[2-3]。近年來，法國(guó)、荷蘭、日本、馬來西亞和熱帶河流中陸續(xù)在水體中檢測(cè)到了敵草隆[4-5]。

血紅素家族中的氯化血紅素（Hemin）因其廉價(jià)和穩(wěn)定性而被廣泛使用，如Hemin可作為基于Fe（Ⅲ）/Fe（Ⅱ）氧化還原對(duì)的電子媒介，具有良好的電催化活性[6-7]。然而，直接應(yīng)用氯化血紅素作為催化劑會(huì)導(dǎo)致鈍化，這是由于Hemin微溶于水并產(chǎn)生無活性二聚體的分子聚集。近年來，由于石墨烯納米材料比表面積大、導(dǎo)電性好，在傳感器領(lǐng)域方面受到了極大的關(guān)注[8]。通過化學(xué)鍵π-π相互作用制備的Hemin功能化的還原氧化石墨烯（Hemin-rGO）復(fù)合納米材料，從而可以引入生物化學(xué)傳感領(lǐng)域。

筆者制備了Hemin-rGO納米材料修飾的玻碳電極（GCE），分析了敵草隆在修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)化了傳感器的電催化性能，并將所制備的修飾電極應(yīng)用于實(shí)際樣品中敵草隆的測(cè)定。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

Hemin，美國(guó)Sigma-Aldrich;敵草隆、水合肼，上海國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司;氧化石墨，南京吉倉(cāng)納米科技有限公司;氫氧化鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、98%濃硫酸、98%硝酸、鹽酸、高錳酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、氯化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;透析袋，MW為7000，Biosharp生物科技有限公司;花蛤樣品購(gòu)于本地超市。

CHI 660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）;場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8020，日本JEOL）;紫外-可見光分光光度計(jì)（UNICO，尤尼柯上海儀器有限公司）。試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1

Hemin-rGO復(fù)合材料的制備。根據(jù)以前的制備方案[9]，在攪拌下將10 mL 0.5 mg/mL氧化石墨烯懸浮液與?10 mL 0.5 mg/mL Hemin（溶于0.1 mol/L NaOH 中）、100 μL氨（28%）混合。然后加入20 μL肼（25%），劇烈攪拌混合物30 min后，將復(fù)合物置于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)24 h。將得到的黑色分散液離心分離，洗滌數(shù)次，干燥得到Hemin-rGO粉末。不添加Hemin制備rGO作為對(duì)照。

1.2.2

Hemin-rGO修飾的GCE的制備。將Hemin-rGO（?5 μL，0.5 mg/mL）溶液滴涂在預(yù)處理過的GCE上，室溫干燥后，用水淋洗數(shù)次以徹底除去未被吸附的Hemin-rGO。按照相同的步驟制備rGO修飾的GCE。制備的傳感器保存在4 ℃下。

1.2.3實(shí)際樣品的前處理。樣品預(yù)處理方法按照國(guó)標(biāo)?GB/T 5009.206—2016[10]。將花蛤樣品用水洗凈后用濾紙吸干，分解出肌肉部分，稱量后將各組織剪碎，充分均質(zhì)。準(zhǔn)確稱量樣品10.0 g放入50 mL離心管中，加入11 mL ?0.5%乙酸溶液（V/V），攪拌均勻后，置于沸水浴中10 min，并持續(xù)攪拌以避免結(jié)塊。冷卻至室溫后，20 000 g高速離心20 min，收集離心后的上清液于25 mL容量瓶中。向沉淀物中加入?11 mL ?0.5%乙酸溶液，均勻攪拌后，置于沸水浴中5 min，攪拌避免結(jié)塊。冷卻至室溫，20 000 g高速離心20 min，移取上清液。合并上清液，攪拌均勻后用0.5%乙酸溶液定容至?25 mL。此提取液1 mL相當(dāng)于0.4 g試樣。

1.2.4

電化學(xué)測(cè)量。采用安培響應(yīng)（i-t）檢測(cè)，底液為N2飽和的5.0 mL磷酸鹽緩沖液（PBS 0.1 mol/L，pH 7.4），工作電位為-0.35 V（vs.Ag/AgCl）。試驗(yàn)過程中，在除氧條件下達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流后，在攪拌下連續(xù)加入敵草隆進(jìn)行測(cè)量。

2結(jié)果與分析

2.1Hemin-rGO 復(fù)合材料的表征

以SEM表征GO、rGO和Hemin-rGO的形態(tài)。如圖1所示，與典型的GO（圖1A）和rGO（圖1B）具有卷邊的片狀形狀相比，Hemin-rGO（圖1C）沒有明顯差異。GO、rGO、Hemin和Hemin-rGO的紫外可見光譜如圖2所示。從圖2可看出，GO的最大吸收峰在?250 nm處，這是由于芳香族C=C鍵的π-π*躍遷。rGO和Hemin-rGO分別在280和275 nm存在吸收峰，與GO吸收峰相比，分別發(fā)生了30和25 nm的紅移，表明在rGO和Hemin-rGO中都存在著rGO的形成和sp2結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。Hemin溶液由于Hemin的Soret帶，在394 nm處有最大吸收峰;而Hemin-rGO在418 nm處的特征吸收為Soret帶的24 nm紅移，表明rGO和hemin之間發(fā)生強(qiáng)烈的π-π堆積相互作用并形成Hemin-rGO。深黑色的Hemin-rGO懸浮液可在4 ℃下穩(wěn)定數(shù)月，由于Hemin和rGO之間存在π-π相互作用，其具有良好的分散性。

2.2傳感器組裝電化學(xué)表征

電化學(xué)交流阻抗法（EIS）是對(duì)電極表面性能研究的有效方法，它能夠直觀地展示出不同修飾電極中的電阻變化。在EIS中，較高頻率的半圓部分和較低頻率的線性部分分別對(duì)應(yīng)于電子限制過程和擴(kuò)散限制過程，并且半圓直徑等于電荷轉(zhuǎn)移電阻（R?ct），結(jié)果顯示如圖3A所示，曲線a表明裸GCE在高頻下呈現(xiàn)出小的半圓，阻抗大約為109.2 Ω;rGO/GCE的電阻顯著降低，其電阻值約為58.1 Ω，這是可能因?yàn)閞GO增加了電極的比表面積，加速了電子的轉(zhuǎn)移;而Hemin-rGO/GCE的R?ct值顯著增加，約為353.4 Ω，原因可能是Hemin作為惰性電子層，會(huì)阻礙電子的轉(zhuǎn)移。EIS的結(jié)果表明，在對(duì)氧化石墨烯一步法修飾、還原過程中，Hemin成功修飾在rGO納米片的表面，電化學(xué)生物傳感器制備成功。同樣，通過循環(huán)伏安法（CV）的氧化/還原過程的峰電位與峰電流值的變化，可以驗(yàn)證rGO和Hemin-rGO在GCE上的修飾狀態(tài)，與EIS結(jié)果相互印證。

2.3試驗(yàn)條件優(yōu)化

為了獲得試驗(yàn)的最佳條件，分別對(duì)Hemin濃度、底液pH、安培響應(yīng)的工作電位進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最佳試驗(yàn)條件為Hemin濃度為0.25 mg/mL，底液pH為?7.4，檢測(cè)敵草隆的最佳工作電位為-0.35 V。

2.4Hemin-rGO/GCE對(duì)敵草隆的線性檢測(cè)范圍

在最優(yōu)的條件下，Hemin-rGO/GCE傳感器對(duì)于不同濃度敵草隆安培響應(yīng)的i-t結(jié)果如圖4所示。傳感器的安培響應(yīng)速率很快，在2 s內(nèi)就幾乎達(dá)到了95%的穩(wěn)態(tài)電流。然后每隔20 s依次向體系內(nèi)注入不同濃度的敵草隆，可以看出隨著敵草隆濃度的增加，響應(yīng)電流也逐漸增加。穩(wěn)態(tài)電流與敵草隆濃度在6.00×10-12～3.24×10-10 mol/L呈良好的線性關(guān)系（圖5），檢測(cè)下限為1.09×10-12 mol/L（S/N=3）。

2.5傳感器的選擇性

為了評(píng)估傳感器的選擇性，選擇了比所測(cè)敵草隆濃度高50倍的7種干擾物（氯化鈉、乙二胺四乙酸、硫酸鉀、苯胺、硝酸鉀、馬拉吡蟲啉、硫磷），結(jié)果如圖6所示。觀察到干擾物在電極上無顯著電流響應(yīng)，表明Hemin-rGO/GCE對(duì)于敵草隆的測(cè)定有較好的選擇性。

2.6傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

使用同批Hemin-rGO/GCE測(cè)量7次同種濃度的敵草?。?×10-11 mol/L），計(jì)算得到的RSD值僅為2.3%，表明該傳感器的重復(fù)性較好。同一根Hemin-rGO/GCE放置在4 ℃的冰箱中9 d后，對(duì)5×10-11 mol/L敵草隆進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示電流響應(yīng)僅比原始響應(yīng)降低了?9.0%，表明該傳感器有較好的穩(wěn)定性。

2.7水產(chǎn)品中敵草隆的檢測(cè)

使用所制備的Hemin-?rGO/GCE對(duì)水產(chǎn)品中（花蛤）的敵草隆含量進(jìn)行檢測(cè)。在最優(yōu)的條件下，將樣品注入電解池記錄其安培響應(yīng)變化。利用標(biāo)準(zhǔn)加入法驗(yàn)證電化學(xué)測(cè)定敵草隆的準(zhǔn)確性。相應(yīng)的結(jié)果見表1，電化學(xué)測(cè)定回收率為93.50%～106.40%。

3結(jié)論與討論

在該研究中，采用SEM和UV-vis表征了一步法制備合成的Hemin-rGO納米復(fù)合材料，并成功構(gòu)建Hemin-rGO/GCE應(yīng)用于敵草隆的測(cè)定。該納米復(fù)合材料具有優(yōu)異的電催化性能，采用安培響應(yīng)i-t的檢測(cè)方法，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，Hemin-rGO/GCE對(duì)敵草隆檢測(cè)的線性范圍為6.00×?10-12～3.24×10-10 mol/L，檢測(cè)限低至1.09×10-12 mol/L。該電化學(xué)傳感器制備簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好，為水產(chǎn)品的檢測(cè)提供了可應(yīng)用的工具。

參考文獻(xiàn)

[1]REN X H，CUI Z J，SUN Y M.Theoretical studies on degradation mechanism for OH-initiated reactions with diuron in water system[J].Journal of molecular modeling，2014，20（7）：2280.

[2]CAMENZULI L，SCHERINGER M，GAUS C，et al.Describing the environmental fate of diuron in a tropical river catchment[J].Science of the total environment，2012，440：178-185.

[3]IHLASEH-CATALANO S M，BAILEY K A，CARDOSO A P F，et al.Dose and temporal effects on gene expression profiles of urothelial cells from rats exposed to diuron[J].Toxicology，2014，325：21-30.

[4]EL-NAHHAL Y，ABADSA M，AFFIFI S.Leaching potential of diuron and linuron in Gaza soils[J].American journal of plant sciences，2014，5：4040-4049.

[5]GATIDOU G，STASINAKIS A S，IATROU E I.Assessing single and joint toxicity of three phenylurea herbicides using Lemna minor and Vibrio fischeri bioassays[J].Chemosphere，2015，119：69-74.

[6]KONG F Y，LI W W，WANG J Y，et al.Direct electrolytic exfoliation of graphite with hemin and single-walled carbon nanotube：Creating functional hybrid nanomaterial for hydrogen peroxide detection[J].Analytica chimica acta，2015，884：37-43.

[7]YANG S L，LUO S L，LIU C B，et al.Direct synthesis of graphene–chitosan composite and its application as an enzymeless methyl parathion sensor[J].Colloids and surfaces B：Biointerfaces，2012，96：75-79.

[8]SANCHS J，OLMOS M，VINCENT P，et al.New insights on the influence of organic co-contaminants on the aquatic toxicology of carbon nanomaterials[J].Environmental science & technology，2015，50（2）：961-969.

[9]CAO X D，GAO J N，YE Y W，et al.Amperometric determination of sulfide by glassy carbon electrode modified with hemin functionalized reduced graphene oxide[J].Electroanalysis，2016，28（1）：140-144.

[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).水產(chǎn)品中河豚毒素的測(cè)定：GB 5009.206—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.