王洋 張政 王瑩瑩 馮國棟 陳丹陽 周宇 牛向麗

摘要以番茄的根、葉、花及不同發(fā)育時期的果實提取RNA，構(gòu)建酵母雙雜交文庫。經(jīng)檢測，文庫容量為1.1×107 CFU，陽性率大于95%，插入片段平均長度大于1 000 bp，可用于互作蛋白的篩選。依據(jù)番茄抗病途徑相關(guān)基因Pti4編碼序列設(shè)計引物，構(gòu)建重組誘餌載體并轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選與Pti4相互作用的蛋白質(zhì)。經(jīng)初步檢測獲得6個可能與Pti4互作的轉(zhuǎn)錄因子，為進一步研究番茄Pti基因的作用機制提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞番茄;酵母雙雜交;Pti4;文庫篩選;蛋白質(zhì)相互作用

中圖分類號Q?943.2文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening of Pti4 Interaction Proteins by Using Yeast Two-hybrid cDNA Library of Tomato

WANG Yang，ZHANG Zheng，WANG Ying-ying?et al（School of Food and Biological Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009）

AbstractRNA was extracted from tomato roots，leaves，flowers and fruits at different development stages to construct yeast two-hybrid library.The detection showed 1.1×107 CFU of total capacity of the library，and the positive rate was greater than 95% with average length of inserted fragments longer than 1 000 bp.According to the coding sequence of tomato disease-resistant Pti4 gene，primers were designed and the recombinant bait vector was constructed，then transformed into yeast to screen the proteins interacting with Pti4.The preliminary screening indicated that six transcription factors might interact with Pti4，which provided a basis for further investigation on the mechanism of Pti genes in tomato.

Key wordsTomato;Yeast two-hybrid;Pti4;Library screening;Protein interaction

番茄（Solanum lycopersicum）作為廣泛種植的果蔬類經(jīng)濟作物，同時也是研究果實發(fā)育、營養(yǎng)品質(zhì)調(diào)控，以及細(xì)菌性病害的模式植物[1-2]。斑點病是番茄種植生產(chǎn)過程中的主要細(xì)菌性病害。從抗病品種中通過圖位克隆方法獲得了番茄抗病基因Pto （P.s.pv.tomato），Pto可以識別病原菌注入植物細(xì)胞的效應(yīng)蛋白、觸發(fā)下游防御反應(yīng)，在番茄的抗病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3]。因此，對Pto介導(dǎo)抗病防御途徑的研究有重要意義。利用酵母雙雜交，Pto被發(fā)現(xiàn)可以與3個轉(zhuǎn)錄因子相互作用，它們被命名為Pto interaction protein （Pti），即Pti4、Pti5和Pti6[4-6]。該課題組也進一步利用植物表達系統(tǒng)驗證了它們在植物體內(nèi)的相互作用[7]。但對Pti基因的作用機制仍缺乏深入了解。

已有的研究報道認(rèn)為，Pti可能是Pto途徑下游基因，可以與許多病程相關(guān)基因的啟動子GCC box元件特異結(jié)合，激活病程相關(guān)基因的表達[8-9]，同時，Pti編碼產(chǎn)物類似于煙草乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白[10]，而乙烯作為一種植物激素，具有促進果實成熟、參與植物抗病免疫反應(yīng)等廣泛的調(diào)控作用[11]。因此，Pti4/5/6的發(fā)現(xiàn)意味著抗病基因與植物激素、基礎(chǔ)防御基因，以及生長發(fā)育調(diào)控之間的必然聯(lián)系。在擬南芥中轉(zhuǎn)入Pti4基因，增強了植株對病原細(xì)菌的抵抗能力，對真菌致病菌的耐受能力也明顯提高。與野生型擬南芥幼苗相比，在不含乙烯時，Pti4過表達幼苗下胚軸的生長受到抑制，在乙烯反應(yīng)突變體ctr中，Pti4轉(zhuǎn)化植株幼苗沒有表現(xiàn)出根系生長的嚴(yán)重抑制或明顯的頂端彎鉤。因此，Pti4的表達似乎激活了乙烯的部分應(yīng)答[6]。這些結(jié)果提示Pti4基因可能參與番茄抗病防御、生長發(fā)育等多個過程，但近年來對Pti基因的研究較少。在高等植物中很多轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白質(zhì)相互作用，共同實現(xiàn)對植物生命活動的精細(xì)調(diào)控。除了Pto蛋白，Pti的互作蛋白信息也還未見報道。該研究將利用番茄的根、葉、花，以及不同時期的果實用于構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，通過文庫篩選獲得Pti互作蛋白信息，以利于后續(xù)對其分子作用機制進行探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。所用的野生型番茄品種AC+來自美國康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所，由該實驗室繁育保存。收集番茄根、葉、花、果實組織，用于構(gòu)建酵母雙雜交文庫。

1.1.2菌株與載體。大腸桿菌菌株E.coli菌株DH5α、KC8，酵母菌株EGY48，以及pEG202、pJG4-5載體，由該實驗室保存。

1.1.3試劑與藥品。質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen），Oligotex mRNA Kit （Qiagen），Trizol （Invitrogen）、反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen），DNA連接酶（NEB），限制性內(nèi)切酶（Takara），DNA聚合酶（Takara），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷（X-gal，Sigma-Aldrich），聚乙二醇3350 （PEG3350，Sigma-Aldrich），鮭魚精 DNA （Carrier DNA，Sigma-Aldrich），酵母氮源[Yeast nitrogen base without amino acid，生工生物工程（上海）股份有限公司]，棉籽糖[Raffinose，索萊寶（北京）科技有限公司]，半乳糖[Galactose，索萊寶（北京）科技有限公司]，葡萄糖[Glucose，索萊寶（北京）科技有限公司]，醋酸鋰[LiAc，生工生物工程（上海）股份有限公司]，氨基酸[包括色氨酸、組氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，所有氨基酸均購于生工生物工程（上海）股份有限公司]。所有試劑與藥品均為國外原裝或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1番茄酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建。取野生型番茄品種AC+植株的根、葉、花、果實（包括未成熟期、綠熟期、轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色后10 d，4個不同時期），分別液氮研磨提取RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000檢測RNA濃度與質(zhì)量。根據(jù)Oligotex mRNA Kit說明分離純化mRNA，并按RNA濃度將各組織樣品等量混合，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于建庫。

按照Clontech公司酵母雙雜交文庫構(gòu)建方法，繼續(xù)將合成的雙鏈cDNA加5接頭，并進行均一化處理。再利用同源重組方法，將純化的雙鏈cDNA與酶切的雙雜交pJG4-5載體進行連接，連接產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)?細(xì)胞。

取轉(zhuǎn)化菌液10 μL稀釋100倍，從中取出10 μL涂布于加入氨芐青霉素的培養(yǎng)板。統(tǒng)計培養(yǎng)皿上生長的克隆數(shù)，計算文庫容量（每皿平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化體積）。挑取平板上的單克隆，通過載體特異引物PJG4-5-F：CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG、PJG4-5-R：AAGCCGACAACCTTGATTGGAG進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，鑒定陽性率及插入片段大小。

1.2.2Pti4載體構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化。根據(jù)番茄Pti4基因（AK319979）編碼區(qū)序列設(shè)計引物：Pti4-FSacⅡ：TCCCCGCGG ATGGATCAACAGTTACCACCG;Pti4-RApaⅠ：CATGGGCCCTTAAATGACCAATAGTTGAT GGACACC，分別引入SacⅡ、Apa Ⅰ酶切位點。以番茄葉片cDNA為模板進行PCR擴增，將預(yù)期大小擴增條帶進行膠回收，連接于載體pEG202，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)酶切鑒定、測序，構(gòu)建pEG202-Pti4釣餌（bait）載體。

利用PEG/LiAc法將pEG202-Pti4載體轉(zhuǎn)化酵母EGY48感受態(tài)，并對酵母單克隆進行PCR菌落鑒定。將轉(zhuǎn)化酵母單克隆劃線于帶有X-gal的培養(yǎng)基進行顯色[13]，檢測誘餌載體pEG202-Pti4是否對酵母細(xì)胞具有毒性，以及是否具有直接激活報告基因的自激活活性。

1.2.3酵母雙雜交文庫篩選Pti4互作蛋白。

以帶有pEG202-Pti4質(zhì)粒的酵母細(xì)胞制備感受態(tài)。參照Golemis等[3]所述文庫篩選試驗方法將上述酵母感受態(tài)細(xì)胞與所構(gòu)建文庫的質(zhì)粒、carrier DNA按比例混合、分裝后，用涂布棒均勻涂布于三缺（-His/-Trp/-Ura）固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)生長至單克隆出現(xiàn)，將菌體刮下加等量甘油保存。取少量上述轉(zhuǎn)化菌液培養(yǎng)后進行梯度稀釋分別涂布于四缺（-His/-Trp/-Ura/-Leu）固體培養(yǎng)基，待酵母單克隆生長后轉(zhuǎn)移至新的四缺固體培養(yǎng)基。然后再將所生長酵母單克隆轉(zhuǎn)移至三缺固體培養(yǎng)基進行封閉，最后將酵母單克隆轉(zhuǎn)至含X-gal的顯色固體培養(yǎng)基，觀察LacZ及Leu報告基因的表達情況，藍(lán)色克隆即為陽性克隆。將陽性克隆進行酵母質(zhì)粒抽提，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli菌株 KC8 （僅轉(zhuǎn)入文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長）。經(jīng)菌落PCR鑒定KC8陽性，提取質(zhì)粒用于酵母雙雜交驗證和測序。對測序獲得的文庫插入序列進行Blast比對分析。

2結(jié)果與分析

2.1番茄cDNA酵母雙雜交文庫的構(gòu)建將野生型番茄AC+植株的根、葉、花、不同生長發(fā)育時期果實（包括未成熟期、綠熟期、轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色后10 d），分別液氮研磨提取RNA。瓊脂糖凝膠電泳顯示，RNA條帶清晰，核糖體條帶清晰且完整 （圖1）。RNA濃度均大于300 ng/μL，A?260/A?280 為2.01～?2.08，顯示RNA質(zhì)量良好，可用于mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄。

雙鏈cDNA加5接頭、均一化處理后與pJG4-5載體進行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。取?10 μL轉(zhuǎn)化菌液稀釋100倍后取10 μL涂布于加入氨芐青霉素的培養(yǎng)板。培養(yǎng)皿平均生長克隆數(shù)為210，計算文庫容量為：每皿平均克隆數(shù)（210個）/涂布體積（10 μL）×稀釋倍數(shù)（100倍）×轉(zhuǎn)化體積（5 000 μL） =1.1×107 CFU。隨機挑取24個克隆，以載體特異引物進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示均有擴增產(chǎn)物，插入片段平均長度大于1 000 bp。結(jié)果表明，所構(gòu)建酵母雙雜交文庫質(zhì)量滿足要求。

2.2Pti4基因酵母雙雜交載體構(gòu)建以番茄葉片cDNA為模板，Pti4基因編碼區(qū)序列特異引物擴增得到702 bp預(yù)期大小PCR產(chǎn)物，純化后經(jīng)Sac Ⅱ、Apa Ⅰ酶切、膠回收，連接于pEG202載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)酶切鑒定、測序，結(jié)果表明獲得pEG202-Pti4釣餌載體（圖2）。將pEG202-Pti4載體轉(zhuǎn)化酵母菌株EGY48感受態(tài)，并對酵母單克隆進行PCR菌落鑒定。陽性轉(zhuǎn)化酵母單克隆劃線于X-gal顯色培養(yǎng)基，?28 ℃生長2 d后酵母克隆正常生長，且未顯示藍(lán)斑。表明Pti4的轉(zhuǎn)入并未對酵母細(xì)胞顯示毒性，在不轉(zhuǎn)入其他外源基因時Pti4對報告基因也不具有激活活性。