王麟，鄭敏,胡鵬，胡雪竹，潘躍承，劉翔

(1.成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,四川 成都,611730；2.成都彭州市天恩醫(yī)院門診部，四川 成都,611930)

目前全球約有20億人曾感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有超過3.5億人最終成為慢性感染者，每年約有60萬人死于慢性或急性乙型肝炎[1]。HBV屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，為部分閉合雙鏈環(huán)狀DNA，基因組全長約3.2 kb。HBV的基因分型主要根據(jù)全基因組核苷酸序列的差異性進(jìn)行，即HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%可定為不同的基因型，目前已定義出了A～J 10種基因型，分布在不同地區(qū)，存在地域差異[2]。據(jù)報道，HBV在復(fù)制過程中會產(chǎn)生錯誤的堿基配對致使核苷酸排列混亂，出現(xiàn)不同的基因型[3]。在長期和不規(guī)范用藥時由于HBV在Pol/RT區(qū)缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶校正功能，使HBV極易發(fā)生基因突變從而產(chǎn)生耐藥情況。不同的流行病學(xué)特點與病毒的表達(dá)方式、致病性與藥物的敏感性都有一定的相關(guān)性[4]。因此，HBV基因分型和耐藥突變位點檢測對乙型肝炎抗病毒治療具有重要的指導(dǎo)意義。但四川西部地區(qū)有關(guān)這方面的研究資料不多，故本研究對四川成都郫都地區(qū)HBV感染者的HBV基因分型和耐藥突變位點進(jìn)行檢測、分析，旨在為臨床抗病毒治療HBV感染提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2019年3月來自四川省成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診及住院收治的169例慢性HBV感染者，診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2010年《慢性乙型肝炎防治指南》。本研究已獲得患者知情同意并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 HBV基因分型及耐藥基因檢測

對每份樣本吸取5 μL血清+5 μL DNA裂解液，室溫10 min，在CFX Connect Real-Time System儀器上進(jìn)行DNA擴(kuò)增，然后再將擴(kuò)增產(chǎn)物在Pol/RT區(qū)進(jìn)行測序。首先，取產(chǎn)物3 μL+2 μL Exo-SAP酶混合物37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min進(jìn)行產(chǎn)物裂解，再把聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)酶解產(chǎn)物1 μL+1 μL測序液通過25個循環(huán)96 ℃ 1 min、96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min進(jìn)行PCR測序，最后純化測序產(chǎn)物(采用醋酸鈉-乙醇法)。將擴(kuò)增后的HBV DNA P基因片段通過堿基序列分析法直接測序后，再利用Chromas軟件進(jìn)行DNA峰形圖的查看與編輯，將結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的基因庫網(wǎng)頁分型工具Genotyping進(jìn)行比對，該工具可將測序結(jié)果與HBV各型參考序列進(jìn)行比對，并通過比對Pol/RT區(qū)變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。HBV不同基因型在性別、年齡、不同突變位點和不同藥物間的分布差異采用列聯(lián)表資料的χ2檢驗、率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV基因型分布特征

2.1.1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型

檢測結(jié)果顯示，以B型和C型為主，其二者百分比均高于D型和BC型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見表1。

表1 169例慢性HBV感染者HBV基因分型情況Table 1 HBV genotyping in 169 patients with chronic HBV infection

注：基因型B與BC和D組(χ2=112.000，P<0.001),基因型C與BC和D組(χ2=60.000，P<0.001)

2.1.2 HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布特征

研究結(jié)果表明，HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.103，P=0.776；χ2=12.521，P=0.185)。在不同年齡間的分布以B型為主，構(gòu)成比>50%；年齡小于20歲的人群中以B型為主，大于20歲的人群中則以B、C型為主，詳見表2。

表2 HBV基因型在不同性別間及不同年齡間的分布特征Table 2 Distribution characteristics of HBV genotype among different genders and ages [例(%)]

2.2 HBV基因突變位點分布特征

研究數(shù)據(jù)顯示，四川成都郫都地區(qū)HBV患者人群中Pol/RT區(qū)耐藥位點無突變的例數(shù)有86例，占50.9%；發(fā)生位點突變的例數(shù)有83例，其中單位點突變?yōu)?0例，占23.7%，雙位點突變?yōu)?9例，占17.1%，三位點突變?yōu)?2例，占7.1%，四位點突變?yōu)?例，占1.2%。研究結(jié)果表明，HBV基因型在多重位點突變率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=55.055，P<0.001)，其中1～2個位點突變者以B型感染為主，構(gòu)成比>60%，3～4個位點突變者以C型感染為主，構(gòu)成比分別為58.4%和50.0%,詳見表3。

表3 HBV基因突變位點分布特征Table 3 Distribution characteristics of HBV gene mutation sites [例(%)]

2.3 HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式

對169例研究對象中檢測出在Pol/RT區(qū)發(fā)生位點突變的83例突變者進(jìn)行分析，共檢出142個突變位點，其中以在M204I/V、L180M位點的突變?yōu)橹?，分別檢出57個突變和30個突變，分別占總突變數(shù)的40.1%和21.1%。在15種不同耐藥突變模式的檢出率上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT區(qū)204、180、236、213、207、250、202、215、194位點突變以B型感染為主，構(gòu)成比≥50%，Pol/RT區(qū)181、238、184、173、214、237位點突變以C型感染為主，構(gòu)成比>53%。其中在B型中檢出A194S/T的突變位點1例。詳見表4。

表4 HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式Table 4 Drug resistame mutation patterns of HBV gene Pol/RT locus [例(%)]

2.4 HBV基因耐藥情況分析

169例HBV感染者中有141例出現(xiàn)耐藥(占83.4%)，對這141例患者進(jìn)行了4種臨床常規(guī)核苷酸類似物(nuoleotide analogue,NAs)藥物檢測。研究結(jié)果表明，拉米夫定(lamivudine，LAM)耐藥為63例，占44.7%；替比夫定(telbivudine，LDT)耐藥為53例，占37.6%；阿德福韋(adefovir，ADV)耐藥為20例，占14.2%；恩替卡韋(entecavir，ETV)耐藥為5例，占3.5%。HBV基因型在這4種抗HBV藥物的耐藥性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐藥比例最高，LDT其次，且均以B型患者為主，占基因型的構(gòu)成比分別為58.7%和62.3%。詳見表5。

表5 HBV基因耐藥情況 Table 5 Analysis of HBV genotype resistance [例(%)]

3 討論

目前，已有很多的研究表明不同基因型HBV感染者的臨床表現(xiàn)受病毒多態(tài)性、宿主個體差異和環(huán)境的共同作用，不同地域、種族、遺傳背景下的人群HBV基因型分布不一致，HBV感染者其病程、抗病毒藥物的治療效果及患者的預(yù)后都與其所感染的HBV基因型相關(guān)[5]。根據(jù)各地區(qū)的型別分布和流行特點，可推斷HBV的傳染源和傳播途徑。我國漢族人群HBV感染者以B型和C型為主，其中南方以B型為主，北方以C型為主，A型和D型在部分地區(qū)也存在[6]。本研究對HBV分型采用的堿基序列分析法直接測序，將基因分型的可靠度和可信度大大提高。結(jié)果顯示，169例四川成都郫都地區(qū)HBV感染者當(dāng)中B型109例，占64.5%；C型57例，占33.7%；D型2例，占1.2%；BC型1例，占0.6%。本地區(qū)基因型以B和C型為主，這與有關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[7]。本研究中檢出2例D型，考慮可能為四川成都郫都地區(qū)人口流動較大所致。

本研究分析了不同性別及不同年齡段基因分布情況，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但發(fā)現(xiàn)年齡小于20歲的人群中以B型為主，占75.0%；20歲以上的人群中則以B、C型為主。這與有些學(xué)者報道B型患者隨著年齡增高構(gòu)成比下降，年齡越大C型構(gòu)成比越高的結(jié)論相一致[8-9]。

本研究表明，Pol/RT區(qū)發(fā)生突變的HBV感染患者中的基因型在多重位點突變率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=55.055，P<0.001)，HBV的RT區(qū)耐藥位點單一位點突變的發(fā)生率最高，為23.7%，雙位點突變其次，為17.1%，在多位點突變中1～2個位點突變者以B型感染為主，構(gòu)成比>60%，3～4個位點突變者以C型感染為主，構(gòu)成比分別為58.4%和50.0%，研究結(jié)果提示，B、C型較D和BC型易產(chǎn)生耐藥基因突變，這與基因型突變研究的有關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[10]。

在對HBV基因突變Pol/RT區(qū)耐藥突變模式檢測分析中，共檢出142個突變位點，其中以M204I/V、L180M位點的突變?yōu)橹鳎謩e檢出57個、30個突變位點，分別占總突變數(shù)的40.1%和21.1%。HBV基因型在檢出的15種不同耐藥模式的突變率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=395.568，P<0.001)。其中，Pol/RT區(qū)204、180、236、213、207、250、202、215、194位點突變以B型感染為主，構(gòu)成比均≥50%；Pol/RT區(qū)181、238、184、173、214、237位點突變以C型感染為主，構(gòu)成比均>53%。其中在B型中檢出A194S/T的突變位點1例，該位點被認(rèn)為與富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)的耐藥相關(guān)。

NAs是治療乙型病毒性肝炎的主要藥物，應(yīng)用最為普遍[11]。目前臨床常用的NAs藥物有LAM、ADV、ETV和LDT，它們作用的靶位均在HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)基因，但NAs藥物長期使用易引起HBV產(chǎn)生耐藥突變，使藥物治療的敏感性降低[12]。本研究169例乙肝患者中對4種NAs產(chǎn)生耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，有83.4%的患者(141/169)會出現(xiàn)一種以上的耐藥突變，比國內(nèi)外HBV的耐藥數(shù)據(jù)(30%～40%)的耐藥現(xiàn)狀更為嚴(yán)峻[13]。可能是由于HBV病毒Pol/RT區(qū)逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，在持久的藥物壓力下HBV突變率較高。對這141例患者進(jìn)行4種臨床常規(guī)NAs藥物檢測，結(jié)果顯示，LAM耐藥為63例，占44.7%；LDT耐藥為53例，占37.6%；ADV耐藥為20例，占14.2%；ETV耐藥為5例，占3.5%。HBV基因型在這4種抗HBV藥物的耐藥情況差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.250，P=0.045)，其中，LAM耐藥比例最高，LDT其次，且均以B型患者為主，占基因型的構(gòu)成比分別為58.7%和62.3%。說明在四川成都郫都地區(qū)HBV感染者中NAs耐藥仍以單一和雙重耐藥為主，并且以LAM和LDT最為顯著。雖然LAM價格低廉、上市早且使用率高，但耐藥最高，不宜作為抗病毒治療的首選藥物。

通過對四川郫都地區(qū)乙肝病毒HBV感染者的基因分型、耐藥突變位點分布和基因耐藥情況的分析，為臨床對評估乙肝患者是否需要抗病毒治療和合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)。