許聰聰 林鷺 梁惠芬 安紅梅 胡兵 張彤 浦益瓊

[摘要] 目的 建立蛇莓藥材中對(duì)羥基桂皮酸的高效液相色譜測定法。 方法 采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-0.2%醋酸（14∶86）為流動(dòng)相，等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為300 nm，柱溫30℃。結(jié)果 對(duì)羥基桂皮酸濃度在0.413～26.450 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），平均加樣回收率為103.52%，RSD為2.61%。3批蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的含量分別為0.11、0.10、0.05 mg/g。 結(jié)論 該方法方便快速，其分離效果好，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于蛇莓藥材的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 蛇莓;對(duì)羥基桂皮酸;高效液相色譜法;含量測定

[中圖分類號(hào)] R284.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of p-hydroxycinnamic in Duchesnea indica （Andr.） by HPLC. Methods Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile-0.2% acetic acid solution （14∶86） was used as the mobile phase of the isocratic elution， with the detection wavelength of 300 nm and the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature maintained at 30℃. Results The concentration of hydroxycinnamic acid in the range of 0.413-26.450 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， with the equation of linear regression of Y=72.592X +1.1304 （r = 0.9999 ）. The average recovery rate was 103.52% （RSD = 2.61%）. The average content of p-hydroxycinnamic acid in 3 batches of Duchesnea indica （Andr.） determined was 0.11， 0.10 and 0.05 mg/g， respectively. Conclusion The method is convenient and rapid， and has good separation effect， high sensitivity and good repeatability. It can be used for quality control of Duchesnea indica （Andr.）.

[Key words] Duchesnea indica （Andr.） Focke; p-hydroxycinnamic; High performance liquid chromatography; Content determination

蛇莓為薔薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.） Focke的全草，別名寶珠草、三葉莓、地莓、三點(diǎn)紅、蛇含草、野楊梅等，為民間常用草藥，在我國分布廣泛[1-2]。蛇莓以全草入藥，性味甘、苦、寒，入肺、肝、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀消腫、收斂止血、涼血之功效，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、咳嗽吐血、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、濕疹、痢疾等[3-4]。藤龍補(bǔ)中湯[5]是龍華醫(yī)院臨床驗(yàn)方，由藤梨根、蛇莓、龍葵、白術(shù)、茯苓、槲寄生、半枝蓮等組成，可用于大腸癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療，而蛇莓是藤龍補(bǔ)中湯組方的君藥之一。目前，相關(guān)研究[6-10]表明，蛇莓具有抗腫瘤、抑菌、增強(qiáng)免疫功能的效果，且對(duì)心血管、平滑肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌也有一定的作用，該中藥還具有顯著的抗腫瘤活性，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

蛇莓所含化合物種類繁多，已經(jīng)從中分離得到的化合物約有70多種，可大致分為6類，包括三萜類、黃酮類、鞣花酸類、香豆素類、甾醇類以及簡單的有機(jī)酸[11-12]。其中，從蛇莓中分離得到的對(duì)羥基桂皮酸在中藥回心草、千里光以及淡竹葉等多味中藥中均有發(fā)現(xiàn)[13-15]。對(duì)羥基桂皮酸能刺激成骨細(xì)胞的骨形成，并通過拮抗核因子κB的活化抑制體外破骨細(xì)胞骨吸收[16];對(duì)羥基桂皮酸在體外與骨轉(zhuǎn)移MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞中，可抑制成骨細(xì)胞礦化的抑制和破骨細(xì)胞生成的增強(qiáng)[17]，該成分在治療胰腺癌、乳腺癌等癌癥骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[18-19]。另外，對(duì)羥基桂皮酸通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞活化和下調(diào)T細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生作用，可能對(duì)特應(yīng)性皮炎具有治療潛力[20]。因此，本研究以蛇莓中的對(duì)羥基桂皮酸為指標(biāo)，建立了其快速、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的測定方法，以期為蛇莓的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 series高效液相色譜儀（VWD檢測器、四元恒流泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器）（美國安捷倫公司）、BS 124S萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）、XS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）、HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SB3200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技公司）。

1.2 試藥

對(duì)羥基桂皮酸（上海譽(yù)恩生物科技有限公司，批號(hào)：240072-201801，HPLC≥98%）;甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純。

蛇莓飲片購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰竞蜕虾ＨA宇藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為160111（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆?、2017082803（上海華宇藥業(yè)有限公司）和171202（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室張紅梅博士鑒定為植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.2%醋酸溶液（14∶86），等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長300 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。

該條件下，樣品中對(duì)羥基桂皮酸色譜分離的理論塔板數(shù)>10000，分離度>1.5，對(duì)稱因子為0.95～1.05，符合定量測定的色譜分離要求。見圖1。

2.2 供試品溶液制備方法考察

2.2.1 提取溶劑考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的甲醇溶液（50%、70%、100%）各25 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次30 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的含量。提取溶劑為70%甲醇時(shí)的提取效果較為理想。見表1。

2.2.2 溶劑體積考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的70%的甲醇溶液（25、50、75 mL）稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次30 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的含量。提取溶劑體積為50 mL的提取效果較為理想。見表2。

2.2.3 提取時(shí)間考察? 取蛇莓藥材（2017082803）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入50 mL 70%甲醇，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），分別每次超聲15、30、45 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的含量。提取時(shí)間為15 min的提取效果較為理想。見表3。

2.2.4 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備? 精密稱定對(duì)羥基桂皮酸對(duì)照品5.29 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成0.529 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.5 供試品溶液制備? 根據(jù)供試品溶液的制備方法考察結(jié)果，最終確定其制備方法為：取本品粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次15 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取對(duì)羥基桂皮酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加一定量的甲醇，制成濃度分別為0.41、0.83、1.65、3.31、6.61、13.23、26.45 μg/mL的一系列對(duì)照品溶液。分別吸取上述的對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算得到回歸方程Y=72.592X +1.1304（r = 0.9999），對(duì)羥基桂皮酸濃度在0.413～26.450 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。見圖2。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別取濃度為0.826 563、3.306 25、13.25 μg/mL對(duì)照品溶液，精密吸取該對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)測定6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，RSD值分別為1.98%、1.42%、1.32%;精密吸取該對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，每天1針，連續(xù)測定6 d，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，RSD值分別為2.27%、3.39%、1.57%。表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取蛇莓藥材粉末約2 g，按“2.2.5”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)行測定，其含量分別為0.011%、0.011%、0.011%、0.011%、0.012%、0.011%、0.011%，RSD為3.90%。表明該樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取蛇莓藥材粉末約2 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.5”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件條件進(jìn)行測定，其含量均值為0.011%，RSD為2.82%。表明該樣品處理方法和含量測定方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的蛇莓藥材粉末約1 g共9份，分別精密稱定，再分別加入相當(dāng)于樣品中對(duì)羥基桂皮酸50%、100%、150%的對(duì)照品，按“2.2.5”供試品溶液的制備項(xiàng)下方法處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，平均加樣回收率為103.52%，RSD值為2.61%。表明該方法測定對(duì)羥基桂皮酸的含量回收率高，準(zhǔn)確性好。見表5。

2.8 樣品測定

取3批蛇莓藥材（160111、2017082803、171202）約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理2次（功率250 W，頻率50 kHz），每次15 min，濾過，合并2次濾液，水浴蒸干，再用25 mL甲醇溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別注入高效液相色譜儀中，測定蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的含量。見表6。

3 討論

本研究考察了甲醇-磷酸水以及乙腈-醋酸水等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，確定以乙腈-0.2%醋酸水=14∶86為流動(dòng)相，在該系統(tǒng)下對(duì)羥基桂皮酸與蛇莓中的其他成分得到了良好分離;考察了樣品提取方法，樣品含有大量葉綠素，干擾測定，直接用甲醇提取，其含量較低，經(jīng)系統(tǒng)比較后，確定了先使用70%甲醇提取、蒸干后再用甲醇復(fù)溶的樣品制備方法，既提高了提取效率，又減少了雜質(zhì)干擾。本研究建立了蛇莓中對(duì)羥基桂皮酸的高效液相色譜定量檢測方法，該方法方便、快速、分離效果好、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于蛇莓藥材的質(zhì)量控制。

藤龍補(bǔ)中湯[5，21-23]是龍華醫(yī)院臨床驗(yàn)方，可用于大腸癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤的治療，尤其在晚期大腸癌的治療方面發(fā)揮顯著作用。該方宗健脾解毒組方，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代藥理研究。既往研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，該方可調(diào)控RKO細(xì)胞多個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞衰老，并可抑制大腸癌肺轉(zhuǎn)移。蛇莓作為君藥之一，發(fā)揮了其抗腫瘤作用。

單味藥蛇莓本身也具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。蛇莓水提取物對(duì)小鼠移植瘤S180（多形細(xì)胞性肉瘤）、H22（肝細(xì)胞瘤）和S37（未分化小鼠肉瘤）的生長有明顯的抑制作用：當(dāng)口服給藥劑量為10.4g生藥/kg時(shí)，對(duì)S37的抑瘤率為70%;而當(dāng)劑量為5.2 g/kg時(shí)，對(duì)S180和H22的抑瘤率分別為59%和31%;另外，蛇莓水提物為生藥0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人胃癌SGC-7901和人食管癌Eca-109細(xì)胞均具有顯著的殺傷作用，殺傷率高達(dá)100%[27]。此外，蛇莓水提物對(duì)鼠肺癌LLC細(xì)胞、人胰腺癌Panc02細(xì)胞和乳腺癌MC-NeuA細(xì)胞的生長亦有較好的抑制作用[28]。

目前，對(duì)中藥蛇莓的研究主要集中在以下幾類成分：三萜類、糖苷類、有機(jī)酸、酚類物質(zhì)、黃酮類等，且大多采用先提取分離、后進(jìn)行系列藥理研究以確認(rèn)其有效性的研究模式，并取得了一定的成效[29-30]。但是，現(xiàn)有研究大多為蛇莓提取物，未有具體單體成分的定量方法。蛇莓的有效部位主要在于哪類成分？能否從有效部位中分離得到有效的單體，并將其作為指標(biāo)性成分？與主要藥理作用的有效成分及其作用機(jī)制是什么？這些問題均不明確。在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，如采用氣質(zhì)聯(lián)用法分析蛇莓中的揮發(fā)性成分（薄荷酮、百里香醌、六氫法呢基丙酮、松茸醇、傘花烴、3-甲基庚醇乙酸酯等）[31]、采用高效液相法測定其他活性成分（齊墩果酸、熊果酸、糅花酸、花色苷）的含量[32-37]，對(duì)蛇莓藥材中的其他相關(guān)活性成分進(jìn)行系統(tǒng)研究和探索，并制訂量化標(biāo)準(zhǔn)，將對(duì)蛇莓的進(jìn)一步質(zhì)控與合理利用，乃至相關(guān)新藥的研發(fā)提供參考，從而保證并優(yōu)化臨床用藥。

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（收稿日期：2018-01-02? 本文編輯：王? ?蕾）