曹 雪， 姜啟興， 夏文水， 許艷順， 王 斌

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

糟魚是我國民間傳統(tǒng)食品，由海水魚或淡水魚經(jīng)數(shù)道工序加工制成，以其獨(dú)特的風(fēng)味口感深受沿湖沿海居民的喜愛。我國的傳統(tǒng)糟魚是一種頗具開發(fā)潛力的優(yōu)質(zhì)發(fā)酵魚制品，但這一傳統(tǒng)美食目前大多是由地方進(jìn)行作坊式生產(chǎn)，規(guī)模較小，受季節(jié)影響大，生產(chǎn)工藝多憑經(jīng)驗(yàn)，產(chǎn)品的安全性和食用品質(zhì)難以保障[1-2]。

目前國內(nèi)關(guān)于糟魚工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)研究的報(bào)道相對較少，各項(xiàng)研究主要集中于糟魚營養(yǎng)價(jià)值分析[2]、配方調(diào)配[3]等方面。張瀟等[4]在研究酢魚產(chǎn)品生物安全性時(shí)表明，20℃的發(fā)酵溫度更能夠兼顧產(chǎn)品品質(zhì)和工業(yè)生產(chǎn)效率。另外，在國外Plaa som、Som fak[5]、Som-fug[6]等報(bào)道了固態(tài)發(fā)酵魚制品的研究。溫度是影響微生物發(fā)酵、產(chǎn)香的重要因素，傳統(tǒng)糟魚制作受季節(jié)局限性，溫度無法控制，從而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)一致性差。不同的發(fā)酵條件尤其是發(fā)酵溫度會(huì)導(dǎo)致這些產(chǎn)品在微生物生長、風(fēng)味及感官品質(zhì)等方面差異較大。因此，了解糟魚在不同糟制溫度條件下品質(zhì)的變化，設(shè)計(jì)工業(yè)化控溫糟制工藝，對于提高產(chǎn)品的品質(zhì)、安全性和一致性具有重要的意義。作者以草魚作為原料，通過對糟魚在不同糟制發(fā)酵溫度條件下的微生物學(xué)特性、理化性質(zhì)的測定及感官評定的分析，系統(tǒng)研究了糟魚發(fā)酵過程的產(chǎn)品品質(zhì)變化規(guī)律，旨為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚的精深加工和工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草魚、糯米、酒曲：購于無錫市華潤萬家超市。

TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀：英國Stable Micro Systems公司產(chǎn)品；CR-400色差儀：日本Konica Minolta公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)：UV2100型，上海尤尼柯儀器公司產(chǎn)品；EL20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；DM2000生物顯微鏡、RM2235石蠟切片機(jī)：德國 Leica產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：Sigma公司產(chǎn)品；立式臺(tái)式殺菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糟魚的制備

1）魚塊制備 鮮活草魚宰殺后去頭、去內(nèi)臟，沖洗干凈后沿魚體側(cè)線取背部魚肉，并將魚切成4cm×4 cm×2 cm的魚塊，魚塊均勻覆以魚塊質(zhì)量12%的鹽，15℃下干腌2～3 h。腌制完畢后，流水沖去表面多余鹽分，于55℃干燥箱中熱風(fēng)干燥，至魚塊水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到55%左右。

2）酒糟制備 將糯米清洗后浸泡于水中，在室溫下浸泡6 h，然后進(jìn)行蒸制，30 min后取出，用無菌冷水沖淋使快速降溫。瀝干水分后加入米飯質(zhì)量0.8%的酒曲，酒曲均勻拌于米飯中并搭窩，加蓋密封后于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 d后使用。

3）糟制 干燥后的魚塊與酒糟按質(zhì)量比1∶2均勻碼放于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐底部先放一層酒糟，然后層魚層酒糟，最上層用酒糟封嚴(yán)，于 4、10、15、20℃下糟制一定時(shí)間。

1.2.2 pH值的測定參考GB/T 9695.5-2008有修改。精確稱取10 g魚肉，加入90 mL蒸餾水用高速分散機(jī)進(jìn)行勻漿，勻漿結(jié)束后立即用pH計(jì)測定樣品的pH值，重復(fù)測定3次。

1.2.3 總酸含量的測定參照Ikenebomeh法[7]進(jìn)行測定。

1.2.4 微生物分析參照GB4789.2-2010有修改。取5 g樣品于無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL無菌生理鹽水，用拍打式均質(zhì)器均質(zhì)3 min。吸取上清液1 mL，等梯度稀釋樣品。選擇3個(gè)合適稀釋度，每個(gè)稀釋度取0.1 mL進(jìn)行稀釋涂布，培養(yǎng)后微生物計(jì)數(shù)。酵母菌用酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD），30℃下培養(yǎng)36 h；乳酸菌用MRS培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)48 h；葡萄球菌用甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（MSA），30℃下培養(yǎng)48 h；腸道菌用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養(yǎng)基（VRBA），37 ℃下培養(yǎng) 24 h。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基氮 （TVBN）含量的測定參照GB/T 5009.44-2003。

1.2.6 硫代巴比妥酸（TBARS）參照Buege J A等[8]方法進(jìn)行測定。用硫代巴比妥酸（TBA）表示魚肉氧化酸敗程度。取2.5 g碎肉，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液高速均質(zhì)30 s，4℃ 5 000 g離心5 min，過濾上清液，取過濾液5 mL與5 mL 0.02 mol/L TBA溶液混合，沸水浴加熱20 min，迅速冷卻20 min，在532 nm處測吸光值?？瞻子? mL三氯乙酸溶液與5 mL TBA溶液混合。TBA值用丙二醛（MDA）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位為mg/kg樣品。

1.2.7 氨基態(tài)氮（ANN）含量的測定采用甲醛滴定法[9]。

1.2.8 色澤和質(zhì)構(gòu)分析將樣品切成2 cm×2 cm×1 cm的小塊，室溫下用色差儀直接測定魚肉的L*、a*和b*值。每組樣品至少重復(fù)3次。將樣品切成2 cm×2 cm×1 cm的小塊，采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀測定鮰魚肉的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠粘性和咀嚼性。測試條件：采用p/25測試探頭，下壓方向與肌肉纖維的走向垂直，壓縮形變50%，觸發(fā)力5 g，測試前速度5 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度5 mm/s。每組樣品至少重復(fù)5次。

1.2.9 感官評定采用嗜好性分析法。將完整糟魚樣品成塊置于品嘗盤中，對樣品隨機(jī)編號，組織20位食品專業(yè)教師和研究生對糟魚進(jìn)行感官評定，采用評分法進(jìn)行打分，評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 糟魚感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of wine-lees fish

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0處理分析，使用Origin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糟制溫度對pH和酸度的影響

圖1 不同溫度條件下糟魚糟制過程中pH和酸度變化Fig.1 Changes in pH and TA in wine-lees fish during wine-lees fermentation at different temperatures

由圖1可知，魚肉糟制前的pH初始值在6.71左右，隨著糟制時(shí)間的延長，各溫度條件下的糟魚pH逐漸下降，滴定酸度隨之逐漸增加，溫度越高，pH和酸度的變化速率越快，這主要是由于溫度越高，產(chǎn)酸微生物生長越快，產(chǎn)酸增多導(dǎo)致的，這可以從圖2中乳酸菌、葡萄球菌的生長趨勢中得到證實(shí)。糟制發(fā)酵至30 d時(shí)，20℃下的魚肉pH達(dá)到了5.14，而4℃條件下的樣品pH還在5.87左右，表明溫度對

2.2 糟制溫度對微生物的影響

圖2顯示了糟魚糟制過程中微生物的變化。作為影響糟魚糟制發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，作者分析了糟制過程中酵母菌、乳酸菌、葡萄球菌以及腸桿菌等4種菌種的變化趨勢。首先，在糟魚的發(fā)酵過程當(dāng)中，隨著時(shí)間的推移，酵母菌（圖 2（a））、乳酸菌（圖 2（b））和葡萄球菌（圖 2（c））的生長基本呈先上升后緩慢下降的趨勢，且溫度越高，微生物越快進(jìn)入穩(wěn)定期或衰亡期。15℃和20℃條件下糟制時(shí)，酵母菌在20 d和15 d時(shí)對數(shù)值分別達(dá)到6.3和6.5，而后基本維持5.5～6.0的平穩(wěn)狀態(tài)直至發(fā)酵成熟末期，10℃下的酵母菌在25 d時(shí)才達(dá)到6，而4℃下的酵母菌生長在這30 d中一直呈現(xiàn)上升趨勢且菌落數(shù)處于相對較低水平，這可能是由于低溫條件造成的微生物生長延滯。乳酸菌作為糟魚中的另一種優(yōu)勢菌，其數(shù)量和生長趨勢與酵母菌生長較為相似。葡萄球菌數(shù)量較乳酸菌和酵母菌略低，且糟制中后期呈較明顯的下降趨勢。推測原因可能是糟制發(fā)酵的微氧條件，以及pH下降造成的酸性環(huán)境導(dǎo)致葡萄球菌在發(fā)酵中后期的生長被抑制[10]。

圖2（d）呈現(xiàn)的是糟魚樣品中腸道菌的變化趨勢，從圖中可看出初始腸道菌數(shù)對數(shù)值在2.5左右，隨著時(shí)間的變化，其生長繁殖大致呈下降趨勢，且糟制溫度越高，下降速度越快，應(yīng)該是其他優(yōu)勢菌的生長抑制了腸道菌的生長繁殖。Lücke F K等[11]的研究表明發(fā)酵肉中pH的下降以及乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素會(huì)抑制雜菌微生物的生長。另外，20℃條件下的糟魚肉在5 d時(shí)達(dá)到了一個(gè)3.3的峰值，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)期的高溫（30℃）糟制發(fā)酵結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，過高的糟制溫度會(huì)導(dǎo)致腸道菌等有害菌的迅速生長，進(jìn)而引起產(chǎn)品品質(zhì)的劣化，也會(huì)影響其他有益菌的生長繁殖。

圖2 不同溫度條件下糟魚糟制過程中微生物變化Fig.2 Microbiological changes in wine-lees fish during wine-lees fermentation at different temperatures

通過酵母菌、乳酸菌和葡萄球菌等微生物在糟制過程中對魚肉的協(xié)同發(fā)酵作用，使得產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、色澤、風(fēng)味、滋味等方面在發(fā)酵熟化期間得到了較大提升。

2.3 糟制溫度對TVB-N的影響

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是動(dòng)物性食品在酶和細(xì)菌的作用下使蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，是反映肉類腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)。

由圖3可知，在各個(gè)發(fā)酵溫度下，糟制5 d后的樣品TVB-N值均隨時(shí)間的延長而上升，且糟制溫度越高，其上升的速率越快，但糟制期間所有樣品均未超過新鮮標(biāo)準(zhǔn)（25～30 mg/hg）。糟制前的魚肉呈現(xiàn)較高水平的TVB-N值，主要是由于在較高的干燥溫度下，魚肉中的內(nèi)源酶作用以及存在的微生物生長繁殖，從而造成蛋白質(zhì)的部分降解[12]。糟制5 d時(shí)，魚肉的TVB-N值較糟制前有大幅下降，這可能是由于糟制前魚肉已經(jīng)干燥，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（55%左右）較低，糟制后，魚肉吸水增重稀釋了TVB-N的濃度，使得TVB-N的比例有所下降；另外，也可能是由于糟制開始后魚肉中的揮發(fā)性氮類物質(zhì)向周圍酒糟環(huán)境擴(kuò)散，或者說是由于這些物質(zhì)在整個(gè)糟制體系中的重新分配導(dǎo)致的；此外發(fā)酵過程中的酸性物質(zhì)與堿性含氮物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)也可能導(dǎo)致TVB-N 值下降[13]。

圖3 不同溫度條件下糟魚糟制過程中TVB-N變化Fig.3 Changes in TVB-N in wine-lees fish during winelees fermentation at different temperatures

2.4 糟制溫度對TBARS的影響

TBARS值是反映肉及肉制品中脂肪氧化程度的重要指標(biāo)之一[14]。魚肉中含有較多的不飽和脂肪酸，極易氧化酸敗而引起產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)地、色澤和營養(yǎng)價(jià)值的改變。

由圖4可知，TBA值基本隨糟制時(shí)間的延長和溫度的增加而升高，發(fā)酵溫度具有顯著影響。但所有糟魚樣品的TBA值都遠(yuǎn)低于魚制品可接受的最大值（5 mg/kg），其在糟制期內(nèi)保持了良好的產(chǎn)品品質(zhì)，可能是由于乳酸菌在不飽和脂肪酸的抗氧化上發(fā)揮了作用[15]。較高的干燥溫度會(huì)導(dǎo)致魚肉脂肪氧化較快，因此起初的糟制樣品會(huì)呈現(xiàn)較高的TBA值。該值在糟制初期迅速下降，一部分原因是糟制前水分含量較低的魚肉會(huì)吸水增重，從而稀釋TBA濃度；另外，也可能是糟制初期魚塊中的相關(guān)成分往酒糟中擴(kuò)散后重新分配導(dǎo)致的；此外，酵母等微生物的作用也能夠清除部分醛類物質(zhì)[16]。

圖4 不同溫度條件下糟魚糟制過程中TBARS變化Fig.4 Changes in TBARS in wine-lees fish during winelees fermentation at different temperatures

2.5 糟制溫度對魚肉蛋白質(zhì)降解的影響

氨基態(tài)氮（ANN）亦稱氨基氮，可以反映出原料中的蛋白質(zhì)水解程度。圖5可知，在糟制過程中，溫度對糟魚的氨基態(tài)氮含量變化具有顯著影響，15℃和20℃下糟制時(shí)ANN值隨糟制發(fā)酵時(shí)間的延長先較快上升再趨于平衡，而4℃和10℃下ANN上升趨勢較為平緩。原因可能是較高的發(fā)酵溫度下，魚肉本身的內(nèi)源酶以及微生物產(chǎn)生的蛋白酶能夠發(fā)揮較高的活力，從而對魚肉中蛋白質(zhì)的降解作用較劇烈[17]。

圖5 不同溫度條件下糟魚糟制過程中ANN變化Fig.5 Changes in ANN in wine-lees fish during wine-lees fermentationat different temperatures

2.6 糟制溫度對魚肉色澤和質(zhì)構(gòu)的影響

色差測定以國際照明委員會(huì)（CIE）的色度系統(tǒng)作為顏色判斷的依據(jù)。根據(jù)表2可發(fā)現(xiàn)，魚肉L*值隨糟制溫度的升高略有下降，而a*值卻隨之增大，高溫糟制賦予魚肉偏紅色澤。溫度較高時(shí)魚肉變暗變紅，可能與肌紅蛋白中的亞鐵血紅素、脂肪的氧化以及美拉德非酶褐變有一定關(guān)系。Riebroy，S等[18]在研究魚糜腸時(shí)也發(fā)現(xiàn)，高溫發(fā)酵會(huì)加速非酶褐變反應(yīng)，使其色澤變暗，白度下降。

用 TPA（Textureprofile analysis）來客觀反映糟魚質(zhì)構(gòu)特性，與感官評定綜合來評判產(chǎn)品感官方面的變化[19]。糟制30 d后，各個(gè)樣品的硬度、咀嚼性、膠粘性相比對照樣都有所減小，且與溫度呈反相關(guān)，彈性和回彈性沒有顯著差異。隨著發(fā)酵溫度的升高，魚肉中水分含量的增加以及更劇烈的蛋白降解都能引起硬度等的減小，同時(shí)有助于改善發(fā)酵前由于脫水預(yù)處理造成的魚肉不良質(zhì)構(gòu)。

表2 不同溫度條件下糟魚糟制過程中色澤和質(zhì)構(gòu)變化Table 2 Color and texture profile analysis of wine-lees fermentation at different temperatures

2.7 感官評定

食品感官品質(zhì)能夠直接反映出消費(fèi)者對食品的感覺，因此在食品品質(zhì)評價(jià)中具有十分重要的地位并得以廣泛應(yīng)用。感官評價(jià)能夠從整體上對食品品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，對于儀器以及實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果具有參照并修正的作用。表3反映了不同糟制溫度對糟魚感官品質(zhì)的影響，從表中可以看出，色澤評分總體隨糟制溫度上升而提高，與色差儀的測定結(jié)果基本一致，15℃和20℃下的糟魚樣品在風(fēng)味、酒味、咸味、異味等指標(biāo)上都有較高的感官評分，但20℃下糟制的魚肉由于魚塊質(zhì)構(gòu)稍過軟爛、外觀完整性較差，因此評分較低。綜合分析，15℃下糟制發(fā)酵成熟的糟魚魚肉的品質(zhì)較好，更受消費(fèi)者喜愛。

表3 糟制溫度對糟魚感官品質(zhì)的影響Table 3 Sensory evaluation of wine-lees fish fermentation at different temperatures

3 結(jié)語

糟魚在糟制發(fā)酵過程中，不同溫度條件會(huì)對魚肉的微生物學(xué)特性、理化性質(zhì)以及產(chǎn)品品質(zhì)具有重要影響。首先，糟魚中的乳酸菌和酵母菌作為優(yōu)勢菌，生長繁殖隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢，生長速度也與溫度呈正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)在一定程度上抑制了葡萄球菌和腸道菌的生長。

糟魚pH在4～20℃的范圍內(nèi)都呈逐漸下降趨勢，而酸度、TVB-N、TBARS和ANN值則基本呈上升趨勢，且隨糟制溫度的升高，趨勢變化越大，但所有樣品的TVB-N值和TBARS值都未超過可接受標(biāo)準(zhǔn)。另外，通過對色澤、質(zhì)構(gòu)以及感官評定結(jié)果的分析，綜合可得，15℃下糟制發(fā)酵成熟的糟魚魚肉的品質(zhì)較好，更受消費(fèi)者喜愛。