曹小飛，李思妹，趙美玲，林云安，向 琪，楊方方，劉國龍，關(guān)明媚

（廣州市第一人民醫(yī)院 腫瘤科，廣東 廣州 510180）

目前，隨著臨床上對于凋亡相關(guān)基因與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展間相關(guān)性研究的深入，多項研究報道髓樣細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）在宮頸癌、肝癌、淋巴瘤以及肺癌等腫瘤組織中的陽性率明顯升高。多位學(xué)者進(jìn)一步研究表明肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌及胃癌等癌組織Mcl蛋白表達(dá)水平與腫瘤臨床分期相關(guān)，但其在卵巢癌中表達(dá)及與臨床分期的關(guān)系研究較少。本文中將采用免疫組化Envision法，探討Mcl-1在卵巢癌組織與健康組織中的表達(dá)差異，以總結(jié)其卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病程2～7年，平均（4.07±1.55）年；TNM分期（美國癌癥聯(lián)合委員會，AJCC）：Ⅰ期40例、Ⅱ期29例、Ⅲ期33例、Ⅳ期11例；其中粘液性癌46例、漿液性癌37例、交界性腫瘤40例；所有標(biāo)本均經(jīng)2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生診斷。另外，選取正常卵巢組織標(biāo)本（20例）與卵巢囊腺瘤組織標(biāo)本（40例）作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

各組分別于正常卵巢組織、卵巢腫瘤周圍組織以及卵巢腫瘤癌變組織進(jìn)行切片取樣，所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)組織處理。

1.2.2 試劑

免疫組化SP試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司

DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司

兔抗人Mcl-1多克隆抗體：Santa Cruz公司

0.01 mol/L檸檬酸型抗原修復(fù)緩沖液（100×）：福州邁新生物技術(shù)有限公司

酶底物顯色劑DAB試劑盒：中杉金橋有限公司

蘇木素復(fù)染液：福州邁新生物技術(shù)有限公司

1.2.3 檢測方法

（1）免疫組化：石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），脫蠟至水，室溫下在3%H2O2中孵育15 min，血清封閉，加入抗Mcl-1抗體孵育8 h（4℃），后用羊抗兔IgG孵育15 min（37℃），再以辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育15 min（37℃），DAB顯色。以扁桃體組織切片作為陽性對照，PBS為陰性對照。

（2）免疫熒光：將細(xì)胞經(jīng)種板、轉(zhuǎn)染、干擾、刺激等處理后用新鮮的多聚甲醛（4%）固定10 min，并用0.2%～0.5%TritonX-100對細(xì)胞進(jìn)行透化處理；加入抗熒光淬滅封片劑封片，并于1周后在顯微鏡下鏡檢。

圖1 Mcl-1蛋白在卵巢癌中呈陽性表達(dá)

圖2 Mcl-1蛋白在卵巢囊腺瘤中呈陽性表達(dá)

Mcl-1蛋白免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)、胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞（見圖1，2），在高倍鏡（×400）視野下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，著淡黃色者為1分，著棕黃色者為2分，著深棕色者為3分。每張切片隨機(jī)觀察5個視野，計數(shù)500個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%者為0分，10%～30%者1分，31%～60%者2分，＞60%者3分。兩項評分相加，0～1.0分為（-），1.1～2.0分為（+），2.1～3.0分為（++），3.1～5.0分為（+++）。（-～+）為陰性，（++～+++）為陽性。

1.3 TNM分期

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本組研究中，所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)計算均采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行，其中計數(shù)資料采用百分比（%）表示，數(shù)據(jù)對比采取x2校驗，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Mcl蛋白在不同臨床分期的卵巢癌組織中表達(dá)

Mcl-1蛋白在卵巢腫瘤Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期癌變組織中的陽性率分別為54.76%、64.29%、76.67%和92.31%，其陽性率與臨床分期相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床分期Mcl-1蛋白陽性率對比（n，%）

2.2 Mcl-1蛋白在正常卵巢組織、卵巢囊腺瘤組織以及卵巢癌組織中的表達(dá)

Mcl-1蛋白在正常卵巢組織、卵巢囊腺瘤組織以及卵巢癌組織中的陽性率分別為5%，32.5%和67.26%，卵巢癌組織的陽性率與其他組織比較差異顯著（P＜0.05），見表2。

表2 不同組織Mcl-1蛋白陽性率對比（n，%）

3 討 論

隨著現(xiàn)階段臨床中關(guān)于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展研究的深入，國內(nèi)外關(guān)于凋亡相關(guān)基因與惡性腫瘤相關(guān)性的報道越來越多，其中Mcl-1、ARIDIA、PDCD4與PDCD5最為熱門。細(xì)胞凋亡（aPoPtosis）屬于基因編碼的程序性細(xì)胞死亡，在生物體發(fā)育、防御及自穩(wěn)中起重要作用。細(xì)胞凋亡并不是一種病理條件下的自體損傷現(xiàn)象，而是主動過程，在凋亡期間會出現(xiàn)激活、表達(dá)以及調(diào)控等變化，進(jìn)而為細(xì)胞在生存環(huán)境爭取更高的生存能力，如果凋亡功能被抑制時，可能會導(dǎo)致淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、肺癌以及前列腺癌等惡性病變的發(fā)生。

Bcl-2蛋白家族己經(jīng)是被公認(rèn)的調(diào)節(jié)凋亡的重要因子，髓樣細(xì)胞白血病-1（Myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）是Bcl-2家族中重要的抗凋亡成員之一，最早定位在線粒體外膜上，其過度表達(dá)在惡性腫瘤早期診斷、治療效果監(jiān)測等過程中具有至關(guān)重要的作用。

多項研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1在多種消化系腫瘤中過表達(dá)，提示Mcl-1對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[5,6]。何勝悅等和趙靜等發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌癌組織的陽性率高于結(jié)腸癌非癌組織（P＜0.05），其表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及5年生存期有關(guān)(P＜0.05)，提示Mcl-1蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,可作為結(jié)直腸癌病理診斷、治療和預(yù)后判斷的指標(biāo)。李峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織Mcl-1陽性表達(dá)率顯著高于對照組（t＝7.835，P＜0.05），其表達(dá)與腫瘤有無壞死和TNM分期有關(guān)（x2＝4.201，P＜0.05），提示Mcl-1蛋白可能參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及向肝癌的惡性轉(zhuǎn)化。

多項體外試驗研究從反面證實(shí)了Mcl-1蛋白在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。魏建勛等[20]研究發(fā)現(xiàn)米托蒽醌能抑制卵巢癌COC1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，此作用可能與米托蒽醌抑制COC1細(xì)胞中的Mcl-1表達(dá)有關(guān)。胡軼等研究表明組蛋白去乙?；敢种苿┣啪谹、硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用于人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3后卵巢癌凋亡相關(guān)蛋白Mcl-1及細(xì)胞凋亡率低于單獨(dú)用藥組（P＜0.05），低劑量的曲古菌素A和硼替佐米聯(lián)合作用誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞系凋亡機(jī)制可能是下調(diào)Mcl-1蛋白表達(dá)。徐長華等研究3,3'-二吲哚甲烷能顯著抑制卵巢癌SKOV3、A2780細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡.綜上所述Mcl-1蛋白在卵巢腫瘤組織中的表達(dá)陽性率與癌分期密切相關(guān)，正反方面說明其在卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可以作為卵巢腫瘤臨床診斷與療效評價的重要指標(biāo)。