曹云剛，馬文慧，艾娜絲，閆林林，趙倩倩，閔紅衛(wèi)，白 雪，黃峻榕,*

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042）

國民經(jīng)濟和社會發(fā)展統(tǒng)計公報顯示，2017年我國豬牛羊禽肉產(chǎn)量達8 431萬 t，其中豬肉產(chǎn)量為5 340萬 t，肉制品加工業(yè)已成為我國食品加工業(yè)的重要組成部分。在肉及肉制品的加工和貯藏過程中蛋白氧化無法避免，氧化會誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響其功能特性及消化率，最終影響肉及肉制品的品質(zhì)[1-3]，給企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。肉蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性是肉糜制品加工的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到肉制品的品質(zhì)[3]。氧化對于蛋白質(zhì)凝膠性能的影響是近年研究熱點，但現(xiàn)有研究報道并不一致。李學(xué)鵬[4]和李銀[5]等的研究結(jié)果表明適度氧化并未改善肉蛋白的凝膠性能。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)適度氧化能提高肉蛋白凝膠性能[3,6-7]，但這些研究均認為過度氧化會嚴重損害蛋白凝膠性能?？梢姡鞍籽趸潭扰c其凝膠性能改變之間的關(guān)系有待進一步系統(tǒng)研究。

已有研究認為，與脂肪氧化類似，蛋白質(zhì)的氧化也是一個自由基鏈式反應(yīng)過程[1-3]。肉制品中常見的蛋白氧化體系主要有3 種：羥自由基氧化體系、脂肪氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)的氧化體系和高鐵肌紅蛋白氧化體系[2]，其中羥自由基氧化體系是肉制品加工中最普遍存在的一種氧化體系，羥自由基也是活性氧自由基中氧化能力最強的自由基[2]。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）占整個肌肉蛋白含量的55%～60%，對肉制品的凝膠性能及感官品質(zhì)起著決定性作用[3]。因此，本研究借助芬頓體系（FeCl3-VC-H2O2）構(gòu)建羥自由基模擬氧化體系，探究不同氧化強度下，MP氨基酸側(cè)鏈修飾、蛋白構(gòu)象、蛋白交聯(lián)和聚集行為以及蛋白熱誘導(dǎo)凝膠性能的變化，探究蛋白氧化程度、結(jié)構(gòu)變化和凝膠性能變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，為深入了解蛋白氧化機制、有效調(diào)控蛋白氧化程度、提高肉品品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬外脊肉（longissimus lumborum）購于當(dāng)?shù)爻?，置于冰盒中運回實驗室后剔除可見脂肪組織，垂直于肌纖維走向切成約100 g的肉排，真空包裝后置于-18 ℃冷凍備用。

水溶性VE（Trolox） 美國Sigma-Aldrich公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS） 美國Ark Pharm公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海源葉生物科技有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）上海麥克林生化科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)（piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（29∶1，V/V）溶液、過硫酸銨（ammonium persulfat，APS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；30% H2O2、FeCl3、抗壞血酸、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；CP213電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微量移液器 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV2900紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TA.Plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司；Fluoro Max-4 熒光分光光度計日本Horiba公司；Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；CM-5分光測色計 柯尼卡美能達（中國）投資有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參照Park等[8]的方法。將豬外脊肉去除脂肪、結(jié)締組織等后切成小條稱質(zhì)量，置于組織搗碎機中并加入4 倍體積的僵直液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Na3PO4、1 mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸、pH 7.0），勻漿搗碎（15 s、4 次）后離心（2 000×g，15 min，4 ℃）。所得沉淀再次加入4 倍體積僵直液，重復(fù)上述步驟共3 次。此時所得沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，勻漿攪拌后經(jīng)4 層紗布過濾，用0.1 mol/L HCl溶液將濾液pH值調(diào)至6.25，再次離心后所得沉淀即為MP。全部提取過程保持在0～4 ℃之間，所得蛋白膏置于塑料離心杯于碎冰中保存，并于48 h內(nèi)使用。以牛血清白蛋白為標準，采用雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.3.2 MP的氧化處理

參考Cao Yungang等[9]的方法，用15 mmol/L pH 6.25的PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl）將MP蛋白膏稀釋為45 mg/mL。分別加入不同強度氧化體系，最終體系蛋白質(zhì)量濃度為30 mg/mL，氧化體系為10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸，0、0.5、1、3、5、10 mmol/L H2O2。所有樣品均置于4 ℃氧化12 h。氧化反應(yīng)通過添加Trolox（終濃度1 mmol/L）終止。未添加氧化體系的蛋白溶液作為空白對照。

1.3.3 脂肪氧化測定

不同處理引起的脂肪氧化采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法測定[10]。稱取約2 g蛋白樣品于玻璃試管中并準確記錄質(zhì)量，分別加入1.5 mL TBA和8.5 mL TCA 溶液，混勻后于100 ℃水浴反應(yīng)30 min后取出，放入冷水浴中冷卻至室溫。通風(fēng)櫥下，移取5 mL上清液至離心試管中，加入5 mL氯仿，密封混勻，3 500 r/min離心10 min后轉(zhuǎn)移3 mL上層液體至一套新的離心管內(nèi)，加入1.5 mL石油醚，混勻并離心后，轉(zhuǎn)移2 mL下層清液于試管后，于532 nm波長處測定吸光度。空白試劑以2 mL 15 mmol/L PIPES溶液替代蛋白樣品溶液。單位以每千克蛋白樣品質(zhì)量計。TBARS值按式（1）計算：

式中：ABS為扣除試劑空白后532 nm波長處的吸光度；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 活性氨基酸殘基修飾程度分析

羰基含量：采用DNPH法進行測定[10]，采用摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol?cm）進行計算；總巰基含量：按照Cao Yungang等[11]的方法，采用DTNB法進行測定；NH3含量：利用TNBS試劑測定；自由氨基含量：參照Adler-Nissen[12]的方法經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整后進行測定；樣品自由氨基含量通過L-亮氨酸制作的標準曲線確定。其中，羰基、總巰基、自由氨基含量以每毫克蛋白樣品物質(zhì)的量計（nmol/mg）。

1.3.5 蛋白構(gòu)象變化分析

內(nèi)源性色氨酸熒光測定：用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將樣品稀釋為0.4 mg/mL，利用Fluoro Max-4熒光分光光度儀于283 nm激發(fā)，記錄290～400 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為1.5 nm。相同條件下記錄溶劑發(fā)射光譜，并從樣品發(fā)射光譜中扣除以排除干擾。

表面疏水性：采用經(jīng)典的ANS熒光探針技術(shù)進行表征，參照Hayakawa等[13]的方法并略作修改進行測定。用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將樣品稀釋為蛋白質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL和0.5 mg/mL的一系列蛋白稀釋液。準確吸取25 μL 8.0 mmol/L的ANS溶液（溶解于pH 8.2的磷酸鹽緩沖液）加入5.0 mL蛋白稀釋液中，試劑空白吸取25 μL pH 8.2的磷酸鹽緩沖液加入到5.0 mL蛋白稀釋液中，渦旋混勻。避光反應(yīng)15 min后進行熒光測定，激發(fā)和發(fā)射波長分別設(shè)定為390 nm和450 nm，狹縫寬度均設(shè)置為5 nm。試劑空白在分析數(shù)據(jù)時扣除。熒光強度對蛋白質(zhì)量濃度作圖所得斜率為表面疏水性指數(shù)（So）。

溶解度測定：用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將蛋白樣品稀釋為2 mg/mL，5 000×g、4 ℃離心15 min。上清液蛋白質(zhì)量濃度（雙縮脲法測定）占2 mg/mL的百分比即為溶解度，按式（2）計算：

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參考Laemmli[14]的方法適當(dāng)調(diào)整。氧化誘導(dǎo)的蛋白交聯(lián)和聚集分別在還原和非還原條件下采用SDS-PAGE分析，濃縮膠和分離膠分別選用4%和12%，每孔上樣量25 μL。染色脫色后拍照并對電泳條帶進行分析。

1.3.6 MP凝膠性能測定

熱誘導(dǎo)凝膠制備：準確稱取5 g MP溶膠樣品置于小玻璃瓶中，用保鮮膜輕輕密封后，置于水浴鍋中，以1 ℃/min從20 ℃加熱至75 ℃，并在75 ℃保溫10 min。取出放入冰水浴中冷卻30 min后置于4 ℃冰箱過夜。測定凝膠性能前，需將凝膠樣品在室溫下平衡2 h。

蒸煮損失測定：用小鏟將凝膠輕輕地與小玻璃瓶壁分開（避免瓶壁的牽引力），倒置于濾紙上20 min，待蒸煮汁液流盡后稱量凝膠質(zhì)量[15]。蒸煮損失按式（3）計算：

凝膠白度測定：參照Xia Xiufang等[16]方法略作修改。分光測色計經(jīng)自檢及零點、白板校正后，進行樣品測定。每個樣品3 組平行，取平均值。凝膠白度值按式（4）計算：

式中：L*為亮度值；a*為紅度值（正值表示偏紅，負值表示偏綠）；b*為黃度值（正值表示偏黃，負值表示偏藍）。

凝膠強度測定：樣品凝膠強度用TA-XT Plus物性分析儀進行測定。測定模式：測前速率5 mm/s；測中速率1 mm/s；測后速率5 mm/s；下壓距離8 mm；探頭型號P/0.5。凝膠強度定義為刺破凝膠所需的初始壓力（N）[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本研究中所有實驗均設(shè)置2～3 次重復(fù)（不同日期），使用Statistix 9.0分析軟件的一般線性模型程序進行方差分析，采用最小顯著差法全配對多重比較進行顯著性分析（P＜0.05），借助SPSS軟件進行各指標之間的相關(guān)性分析，采用SigmaPlot 12.5軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2濃度對MP中脂肪氧化的影響

表1 氧化強度對脂肪和蛋白氧化的影響Table 1 Effects of different oxidation degrees on lipid and protein oxidation

本研究所用方法提取的MP中不可避免會含有少量脂肪。Xiong Youling等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MP中殘余脂肪約占其干質(zhì)量的0.49%，主要來源于肌肉細胞膜中的磷脂。由于磷脂富含不飽和脂肪酸極易發(fā)生氧化，從而生成醛、酮、醇、酸等物質(zhì)，其中的醛類等活性物質(zhì)可進一步與蛋白氨基酸側(cè)鏈發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化。因而評價不同氧化強度處理對脂肪氧化的影響對于分析其對蛋白氧化的影響意義重大。TBARS法主要用于脂肪次級氧化產(chǎn)物（如丙二醛等）含量的測定，因而在本研究中被選用于脂肪氧化程度評價。

如表1所示，空白對照樣品的T B A R S值約為1.27 mg/kg，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的TBARS值上升至約6.87 mg/kg，說明Fe3＋和VC可以誘導(dǎo)脂肪氧化。王燕榮[19]研究發(fā)現(xiàn)在各種包裝（真空、高氧氣調(diào)和低氧氣調(diào)）條件下VC都有促進冷卻肉中脂肪氧化的作用，這可能與肉中含有金屬離子（如Fe3＋等）有關(guān)。楊念[20]研究發(fā)現(xiàn)2 mg/kg Fe3＋明顯降低BHT在雞油中的抗氧化性，這可能與Fe3＋自身的促氧化性有關(guān)。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，當(dāng)H2O2濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L時，其TBARS值均在6.0 mg/kg以上，但此后隨H2O2濃度升高TBARS值呈下降趨勢，這可能是強氧化條件下脂肪氧化生成的醛類物質(zhì)與蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈發(fā)生了共價結(jié)合。章銀良等[21]研究發(fā)現(xiàn)蛋白與氧化脂肪結(jié)合導(dǎo)致體系中TBARS值下降，同時蛋白羰基含量升高。

2.2 H2O2濃度對MP氨基酸側(cè)鏈修飾的影響

蛋白質(zhì)中羰基含量是蛋白氧化的重要指標，一般來說，羰基含量越高代表蛋白氧化程度越高。如表1所示，空白對照樣品的羰基含量為6.29 nmol/mg，與李學(xué)鵬等[4]報道的未氧化草魚MP羰基含量基本一致（5.37 nmol/mg）。但李銀等[5]研究發(fā)現(xiàn)未氧化豬肉MP羰基含量約為1.17 nmol/mg，與本研究結(jié)果差異較大，這可能與實驗用肉來源等不同有關(guān)。添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的羰基含量為6.42 nmol/mg，與空白對照相比無顯著性差異（P＞0.05）。值得注意的是相同處理導(dǎo)致樣品的TBARS值急劇上升，但蛋白羰基、總巰基和自由氨基含量無顯著變化（表1），說明脂肪氧化與蛋白氧化并不同步。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，隨著H2O2濃度的增加，MP羰基含量呈現(xiàn)上升趨勢（P＜0.05）。當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，蛋白羰基含量升至12.70 nmol/mg，與空白對照組相比增加了102%。與本實驗結(jié)果類似，前人研究發(fā)現(xiàn)豬肉MP羰基含量隨芬頓體系H2O2濃度增加而顯著上升[3,10,22]。

MP富含巰基，暴露于氧化條件下易轉(zhuǎn)化為二硫鍵（—S—S—）導(dǎo)致巰基含量降低，因而巰基含量是蛋白氧化的重要指標。如表1所示，空白對照樣品的總巰基含量約為60.3 nmol/mg，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的總巰基含量約為61.7 nmol/mg，二者之間無顯著性差異。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，當(dāng)H2O2濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L時，其總巰基含量與空白對照相比均無顯著性差異（P＞0.05）。但隨著H2O2濃度的增加，MP總巰基含量顯著下降（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，蛋白總巰基含量降至53.2 nmol/mg，與空白對照組相比降低了12%。這與胡忠良等[23]報道的三黃雞MP總巰基下降趨勢總體一致。

賴氨酸的ε-NH2基團非常容易受到羥自由基攻擊轉(zhuǎn)化為羰基，而形成的羰基與氨基可進一步反應(yīng)形成席夫堿，從而使自由氨基含量進一步下降[24-25]。如表1所示，空白對照樣品的自由氨基含量為86.2 nmol/mg，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的自由氨基含量約為86.9 nmol/mg，二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，隨H2O2濃度增加自由氨基含量顯著降低，當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，自由氨基含量約為70.7 nmol/mg，與空白對照組相比降低了約18%。

2.3 H2O2濃度對MP構(gòu)象穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光特性對于其所處微環(huán)境十分敏感，可被用來反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。一般來說，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時，其熒光強度較強而最大發(fā)射波長相對較短；當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)展開時，熒光強度較低而λm較長。如圖1所示，空白對照樣品最大發(fā)射波長處的熒光強度約為66.9×104，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的熒光強度約為68.9×104，與空白對照相比熒光強度略有上升，并且最大發(fā)射波長從328 nm紅移到331 nm。這可能與Fe3＋和VC添加誘導(dǎo)的脂肪氧化產(chǎn)物對MP色氨酸所處微環(huán)境的影響有關(guān)。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，隨著H2O2濃度的增加，熒光強度顯著下降，尤其是當(dāng)H2O2濃度超過1.0 mmol/L時，下降尤為顯著（P＜0.05）。當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，熒光強度約為44.9×104，與空白對照相比降低了33%，這是由于隨著氧化強度的增加，MP結(jié)構(gòu)逐漸展開，使色氨酸殘基等熒光基團暴露于極性環(huán)境中，從而導(dǎo)致MP熒光強度降低。

圖1 氧化強度對MP內(nèi)源熒光的影響Fig. 1 Effect of different oxidation degrees on intrinsic fluorescence intensity of myofibrillar protein

圖2 氧化強度對MP表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of different oxidation degrees on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

ANS熒光探針可與蛋白分子表面的疏水性氨基酸結(jié)合，如苯丙氨酸和色氨酸[26]，從而確定蛋白表面疏水性氨基酸的相對含量，進而反映蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。如圖2所示，空白對照樣品的表面疏水性約為718.8，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的表面疏水性約為708.7，二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，當(dāng)H2O2濃度在0.5～3.0 mmol/L范圍時，隨著H2O2濃度的增加，MP的表面疏水性顯著下降（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度在3.0～10.0 mmol/L范圍時，MP的表面疏水性略有上升但無顯著性差異，當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，表面疏水性約為642.8，與空白對照組相比降低了11%。這可能是由于隨著氧化強度增強，MP結(jié)構(gòu)展開疏水集團暴露后，又通過疏水相互作用聚集（圖2，溶解度下降）使得表面疏水性降低。

2.4 H2O2濃度對MP交聯(lián)聚集及溶解度的影響

圖3 不同氧化程度的MP SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein at different oxidation degrees

氧化會誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間二硫鍵及其他共價鍵交聯(lián)，進而可能影響蛋白的溶解性及其他功能特性，比如凝膠性能[1]。在非還原條件下（圖3a），隨著H2O2濃度的增加，MP樣品中肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶逐漸變淺，同時濃縮膠頂端大分子聚合物明顯增多，說明這些聚合物中主要包含了肌球蛋白重鏈和肌動蛋白。在還原條件下（加入還原劑DTT后，圖3b），濃縮膠頂端聚合物條帶明顯減弱，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶明顯加粗，說明這些聚合物主要是由二硫鍵交聯(lián)形成的，但仍有些許肌球蛋白重鏈條帶沒有恢復(fù)，說明聚合物中還存在其他共價鍵，如酪氨酸-酪氨酸和活性羰基-氨基等[1,27]。

圖4 氧化程度對MP溶解度的影響Fig. 4 Solubility of myofibrillar protein at different oxidation degrees

如圖4所示，空白對照樣品的溶解度約為57.1%，添加Fe3＋和VC（H2O2添加量為0.0 mmol/L）樣品的溶解度約為40.4%，與空白對照相比顯著減?。≒＜0.05）。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，隨著H2O2濃度的增加，MP溶解度顯著下降（P＜0.05），當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，蛋白溶解度降至28.9%，與空白對照組相比降低了49%。這與Srinivasan等[28]報道的氧化能顯著降低魚肉蛋白的溶解度基本一致。氧化導(dǎo)致MP溶解度下降可歸因于2 個方面：第一，氧化導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)展開疏水基團暴露，蛋白分子間疏水相互作用增強，導(dǎo)致蛋白聚集溶解度下降；第二，氧化導(dǎo)致巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化從而引起蛋白質(zhì)聚集，導(dǎo)致MP溶解度降低。

2.5 H2O2濃度對MP凝膠性能的影響

表2 氧化強度對MP熱誘導(dǎo)凝膠性能的影響Table 2 Effects of different oxidation degrees on heat-induced gel properties of myo fi brillar protein

如表2所示，空白對照樣品的蒸煮損失約為19.3%，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的蒸煮損失約為21.1%，與空白對照對比略上升但并不明顯（P＞0.05）。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，隨著H2O2濃度的增加，蒸煮損失明顯上升，當(dāng)H2O2濃度為10.0 mmol/L時，蛋白蒸煮損失為33.5%，與空白對照相比升高了74%。這可以歸因于隨著氧化強度的增加，MP溶解度顯著下降（圖3），導(dǎo)致參與成膠的蛋白大大減少，凝膠孔隙增大、持水性嚴重降低，蒸煮損失顯著上升（P＜0.05）。

不同處理MP熱誘導(dǎo)凝膠的白度均為88.1，無顯著性差異（P＞0.05），說明凝膠白度受氧化程度影響不顯著。李銀等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著氧化強度增強，豬肉MP熱誘導(dǎo)凝膠白度呈下降趨勢。這些不一致的實驗結(jié)果可能與實驗所用MP來源不同等因素有關(guān)。

空白對照樣品的凝膠強度為0.60 N，添加Fe3＋和VC（H2O2濃度為0.0 mmol/L）樣品的凝膠強度為0.57 N，與對照相比略有降低但無顯著性差異（P＞0.05）。添加芬頓體系（Fe3＋、VC和H2O2）的樣品，當(dāng)H2O2濃度在0.5～1.0 mmol/L范圍時，蛋白凝膠強度降至0.54 N，與空白對照組相比降低了12%（P＜0.05）。此后隨著H2O2濃度的增加，MP凝膠強度無明顯變化（P＞0.05）。

2.6 相關(guān)性分析

表3 各指標相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between H2O2 concentration and physicochemical and heat-induced gel properties of myo fi brillar protein

如表3所示，H2O2濃度與MP中羰基含量正相關(guān)（r=0.795，P=0.059）；與總巰基含量（r=-0.907，P＜0.05）、自由氨基含量（r=-0.844，P＜0.05）、內(nèi)源性熒光（r=-0.822，P＜0.05）和溶解度（r=-0.846，P＜0.05）顯著負相關(guān)；與凝膠強度呈負相關(guān)（r=-0.694），但相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。蛋白氧化指標（羰基、總巰基、自由氨基和內(nèi)源性熒光）均與MP溶解度和熱誘導(dǎo)凝膠蒸煮損失呈顯著相關(guān)；同時總巰基及自由氨基含量與凝膠強度分別呈顯著（r=0.827，P＜0.05）或極顯著（r=0.922，P＜0.01）正相關(guān)；蛋白溶解度與凝膠強度呈正相關(guān)（r=0.790，P=0.062），與蒸煮損失呈極顯著（r=-0.951，P＜0.01）負相關(guān)。這表明H2O2濃度越高，蛋白氧化程度越嚴重，蛋白質(zhì)溶解度越低，蒸煮損失越嚴重，凝膠強度越低。

3 結(jié) 論

本實驗主要研究不同氧化強度對豬MP結(jié)構(gòu)和熱誘導(dǎo)凝膠性能的影響及其相關(guān)性。結(jié)果表明：隨著H2O2濃度升高，羰基含量上升，總巰基、自由氨基和內(nèi)源熒光強度下降，蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集行為增強，溶解度下降，熱誘導(dǎo)凝膠蒸煮損失上升，凝膠強度下降，但凝膠白度無明顯變化。同時實驗探究了不同氧化強度對MP中殘余脂肪氧化的影響，結(jié)果表明當(dāng)H2O2濃度為0 mmol/L時脂肪氧化程度（TBARS值）最大，隨H2O2濃度增大TBARS值呈下降趨勢。這表明Fe3＋和VC即可顯著誘導(dǎo)脂肪氧化，脂肪氧化與蛋白氧化并不同步。