葉姜瑜，李大榮，陸榆豐，李 媛，竇建軍

（1.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶400045；2.重慶融極環(huán)保有限公司，重慶400000）

聚甲醛（Polyoxymethylene）是世界五大通用塑料之一，由于硬度大、剛度好、耐疲勞度高且自帶潤滑性，有“超鋼、奪鋼”之稱[1]，被廣泛應(yīng)用于日用輕工、汽車、建材、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療器械等領(lǐng)域[2-4]。中國煤化工企業(yè)近年來發(fā)展迅速，很多煤化工企業(yè)建立了聚甲醛生產(chǎn)項目。不過，聚甲醛生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢水含有甲醛、三聚甲醛（s-Trioxane，TOX）、二氧五環(huán)、甲縮醛和酚類等有害物質(zhì)，具有鹽分高、化學(xué)需要量（COD）高等特征，很難生物處理至達標排放，對環(huán)境和人體有極大的危害，成為亟待解決的問題。目前針對聚甲醛廢水常見的處理方法有石灰法，高級氧化法如Fenton氧化法、濕式氧化法、臭氧催化氧化法，復(fù)合工藝法等[5]。但這些方法將產(chǎn)生大量化學(xué)污泥、條件要求苛刻、運行成本較高、工藝管理困難，因此應(yīng)用受限。普通生物法雖然能克服以上缺點，但由于甲醛、TOX等有毒物質(zhì)的抑制作用，許多微生物活性喪失，無法實現(xiàn)有效生物降解。

目前針對聚甲醛廢水中甲醛成分降解研究較多，且已分離出對甲醛具有代謝作用菌株，如產(chǎn)青霉素菌Penicillium chrysogenum[6]、蒙氏假單胞菌Pseudomonas monteilii[7]、紅串球菌Rhodococcus erythropolis[8]、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida[9]等。不過，對聚甲醛廢水主要污染物之一TOX的生物降解研究仍較少，到目前為止仍少見TOX降解菌株的報道。我們馴化分離了一株以TOX為碳源的細菌，將其與甲醛降解菌群復(fù)合后進行了聚甲醛廢水的生物強化研究，結(jié)果表明其對聚甲醛類污水有良好的處理效果，可作為復(fù)合菌劑的組成成分。

1 材料與方法

1.1 菌源和水樣

菌株分離于某化工廠聚甲醛污水廠調(diào)節(jié)池底泥；活性污泥取自曝氣池；聚甲醛廢水取自于調(diào)節(jié)池。污水水質(zhì)為：COD 3413 mg/L，HCOONa 3000～3500 mg/L，甲醛 135～250 mg/L，TOX 130～240 mg/L，DOX 37 mg/L，CH3OH 110 mg/L。

1.2 培養(yǎng)基

基本無機鹽培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO40.7，K2HPO40.85，（NH4）2SO41.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001，1×105Pa 滅菌 20 min。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，氯化鈉 10，酵母浸出粉 5，于 pH 7.0，1×105Pa 滅菌 20min。用于菌株富集擴培。

TOX降解菌培養(yǎng)基：基本無機鹽培養(yǎng)基高壓滅菌后加入一定量0.2 μm濾膜滅菌的TOX溶液。

1.3 菌株來源

TOX降解菌的分離純化：取10 mL底泥與污水混合物，加至LB培養(yǎng)基，于恒溫搖床30℃培養(yǎng)24 h；取5 mL所得擴培菌液，加至100 mL含TOX濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，恒溫搖床30℃培養(yǎng)48 h，取菌液5 mL，如此反復(fù)接種所得菌液4～5次，每次接種LB培養(yǎng)基按梯度降低100 mg/L酵母粉，同時增加100 mg/L TOX，最后一次TOX濃度達500 mg/L；選擇最終菌液樣品于含400 mg/L TOX的LB固體培養(yǎng)基上稀釋涂布，并挑取所得菌落劃平板，培養(yǎng)48h；反復(fù)劃平板得到純菌株，-20℃下甘油保種備用。

甲醛降解菌：重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院微生物分子生態(tài)學(xué)實驗室保存菌株麥芽糖假絲酵母（Candidamaltosa）和惡臭假單胞菌（Pseudomonsa putida）[10]。

1.4 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：觀察菌株在LB固體培養(yǎng)基上形成的單菌落形態(tài)特征，包括菌落顏色、邊緣平整度和表面濕潤性等。用解剖針挑取少許培養(yǎng)皿上的菌落，混合于載玻片的無菌水滴中，光學(xué)顯微鏡下觀察其個體形態(tài)特征。

革蘭染色：對細菌進行革蘭染色：包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等4個步驟，于光學(xué)顯微鏡下進行鑒別。

分子生物學(xué)鑒定：對單菌株進行基因組提?。▍⒄占毦鶧NA提取試劑盒步驟）；對所得基因組采用細菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1 492R（5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3）[11]進行擴增，將所得產(chǎn)物送與南京金斯瑞生物科技有限公司測序；利用NCBI軟件中的BLAST對實驗菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較[12]。

1.5 環(huán)境因子對微生物生長影響的測定

菌株生長曲線測定：將活化后的分離菌株按體積分數(shù)1%接種于TOX質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基；定時取樣測定菌液OD600值。

pH值對菌株生長的影響：恒溫培30℃培養(yǎng)，分別配制 pH 值梯度為 4、5、6、7、8 和 9，TOX 質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基，按1%接種菌液，定時取樣測定OD600值。以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

溫度對菌株降解TOX的影響：設(shè)置20、25、30、35℃和40℃5個溫度梯度，于TOX濃度為400 mg/L的基本無機鹽培養(yǎng)基中加入體積分數(shù)為5%離心后的純菌體，24 h后取樣測定TOX降解率。

NaCl濃度對菌株生長的影響：以TOX質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基為基質(zhì)，分別配制NaCl質(zhì)量濃度為 1、1.5、2、3 g/L 和 4 g/L 的培養(yǎng)基，按體積分數(shù)1%接種菌株，定時取樣測定OD600值，以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

菌株對不同質(zhì)量濃度TOX的降解實驗：以前期實驗最優(yōu)條件為基礎(chǔ)，配制TOX質(zhì)量濃度分別為100、200、400、600、800、1100 mg/L 和 1500 mg/L不同梯度基本無機鹽培養(yǎng)基，菌液按體積分數(shù)2%離心（10000 r/min）并接種，以時間為橫坐標，TOX降解率為縱坐標繪制曲線。

以上均使用250 mL三角錐形瓶，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.6 指標測定

COD測定：HACH消解法[13]；甲醛測定：乙酰丙酮分光光度法；TOX測定：參照侯麗等[14]的頂空色譜毛細柱法方法。

1.7 聚甲醛廢水生物強化實驗

建立A、B、C和D共4組平行小試反應(yīng)器。各反應(yīng)器有效容積為3.5 L，啟動前均加入等量經(jīng)該污水馴化后的活性污泥。A組：未加其他菌劑；B組：加入TOX降解菌；C組：加入甲醛降解菌；D組：同時加入TOX降解菌與甲醛降解菌。統(tǒng)一進水，曝氣，定時取樣測定各出水CODcr、甲醛和TOX。其中TOX降解菌和甲醛降解菌分別由TOX質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基和甲醛質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)16 h后所得；各系統(tǒng)菌液按體積分數(shù)2%離心（10000 r/min）后投加；D組單菌與甲醛降解菌投加比例為1∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 TOX強降解菌的分離鑒定及生長曲線

通過底泥富集馴化、分離，獲得幾株TOX降解菌株。其中一株Q1優(yōu)勢菌生長良好，其菌落形態(tài)米白色，表面干燥，邊緣光滑齊整，中間凹陷，菌落較厚（圖1）；顯微鏡形態(tài)呈桿狀：革蘭染色陽性（G+）。對該菌株進行16S rDNA基因測序，其結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，該菌被確定為與最高同源性98%的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）相同。對其進行生長曲線測定，結(jié)果表明，接種4 h內(nèi)，OD600值上升較為平緩，為該菌適應(yīng)期；隨后進入對數(shù)期，菌株呈現(xiàn)快速增長；16 h進入穩(wěn)定期初期，此時活性較好，被確定為接種期。

圖1 菌株B.methylotrophicus的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological identification of B.methylotrophicus

2.2 環(huán)境因子對B.methylotrophicus生長的影響

聚甲醛污水中污染物質(zhì)（如TOX、二氧五環(huán)等）組分及含量都有很大的不確定性，COD變化大，且正常生產(chǎn)情況下水質(zhì)偏酸性、工段投加大量NaOH等原因，使得聚甲醛廢水含鹽質(zhì)量分數(shù)為1.5～2.5 g/L，屬于高鹽類工藝廢水。環(huán)境因子pH值、溫度和離子濃度等對菌株B.methylotrophicus生長的影響見圖2～4。

圖2 pH值對菌株B.methylotrophicus生長的影響Fig.2 Effects of pH on activities of B.methylotrophicus

圖3 溫度對B.methylotrophicus降解TOX的影響Fig.3 Effects of temperature on degradation of B.methylotrophicus to TOX

圖4 NaCl質(zhì)量濃度對菌株B.methylotrophicus生長的影響Fig.4 Effects of NaCl concentration on activities of B.methylotrophicus

由圖2可知，菌株對pH變化較敏感，酸堿對該菌的影響都較大。培養(yǎng)基pH值為7時，菌株進入穩(wěn)定期時間提前至16 h，此時OD600峰值相對最高，確定其最佳生長pH為7。而當(dāng)溫度為30℃時，該菌有最高的TOX降解率91.63%（圖3），表明該菌株屬于中溫微生物類型。由圖4可看出，鹽離子濃度對該菌的影響較大，隨著NaCl質(zhì)量濃度的提高，菌株適應(yīng)期逐漸加長、穩(wěn)定期種群數(shù)量下降。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為1、1.5 g/L和2 g/L時，生長曲線表明該菌有較好的適應(yīng)性；NaCl質(zhì)量濃度超過3 g/L以后，菌株生長受到較明顯抑制，穩(wěn)定期時種群數(shù)量明顯下降。生產(chǎn)性聚甲醛廢水的鹽濃度應(yīng)在該菌耐受范圍內(nèi)。

2.3 菌株B.methylotrophicus對不同濃度TOX的降解

B.methylotrophicus對TOX的降解效率見圖5。當(dāng)TOX質(zhì)量濃度為100～400 mg/L時，菌株能迅速適應(yīng)底物，并以TOX作為碳源實現(xiàn)快速降解，在24 h內(nèi)TOX降解率可達90%左右；隨著底物濃度的逐步提高，菌株適應(yīng)期隨之變長，但600 mg/L以下都有較好的降解率；當(dāng)TOX質(zhì)量濃度提升至1200 mg/L時，在40 h內(nèi)TOX降解率僅為21.84%，表明TOX對該菌已表現(xiàn)出明顯的抑制性，對菌株表現(xiàn)出極大毒性，初步判定菌株B.methylotrophicus對TOX降解的耐受濃度為1200 mg/L。

圖5 不同TOX質(zhì)量濃度下菌株B.methylotrophicus的降解率Fig.5 Degradation of B.methylotrophicus to different TOX concentration

2.4 聚甲醛廢水的生物強化處理

聚甲醛廢水COD的主要構(gòu)成為HCOONa、甲醛、TOX和醇類等，其中甲醛與TOX為主要有毒物質(zhì)。對該污水生物強化處理后反應(yīng)系統(tǒng)最終出水水質(zhì)及降解率見表1，其降解趨勢見圖6。

表1 各系統(tǒng)出水污染物濃度及其降解率（60 h）Table1 Concentration of pollutants in effluents and its degrading efficiency（60 h）

圖6 反應(yīng)系統(tǒng)中COD降解時的甲醛、TOX濃度變化Fig.6 Variation of formaldehyde,TOX and COD in Systems

由圖6可知，系統(tǒng)啟動后，各組COD均呈下降趨勢，其中A組較為平緩，B、C組次之，D組最快；A組最終出水的COD降解率僅為75.16%，而D組最終降解率達92.80%（表3）。此外，各系統(tǒng)COD均隨甲醛、TOX的降低而降低，對照組A的甲醛和TOX降速都極為緩慢，而B組的甲醛、TOX降解速率與降解率均有一定提高，其降解率分別為72.16%和55.97%，但TOX相對A組降解率僅提高了25.69%。C組的甲醛降解率高達94.89%，但對TOX降解率仍極低為30.45%，相對A組變化也不大。而D組由于同時加入了甲醛降解菌與TOX降解菌B.methylotrophicus，其甲醛和TOX的降解率都有明顯提高，達96.52%和95.88%，同時COD降解率也提高至92.80%，其各項指標均遠優(yōu)于A、B、C組。

本研究顯示，當(dāng)僅加入B.methylotrophicus時，由于受到其他如甲醛等物質(zhì)的抑制作用，并不能發(fā)揮其最佳活性將TOX完全降解（如圖6 B）；僅加入降甲醛混合菌時，雖甲醛去除率高，但缺少TOX的降解菌，TOX的質(zhì)量濃度較高，仍然抑制了活性污泥中的其他微生物群落，致使其COD降輻相對B組變化不大（如圖6（c））；當(dāng)同時加入TOX降解菌與甲醛降解菌時，菌株之間展示出良好的協(xié)同作用，實現(xiàn)了甲醛、TOX的同步快速降解，消除了抑制微生物的毒性物質(zhì)，從而其他COD降解菌種群逐漸增強、COD隨之大大降低?？傮w看來，各處理組出水水質(zhì)優(yōu)劣為：D組（TOX降解菌+甲醛降解菌）＞C組（甲醛降解菌）＞B組（TOX 降解菌）＞A 組（對照組）。因此，無論是B.methylotrophicus，還是甲醛降解菌單獨的生物強化，均只能實現(xiàn)單一有毒物質(zhì)的部分降解，只有多菌株生物強化后協(xié)同降解聚甲醛廢水的有毒底物，才能真正有效地實現(xiàn)聚甲醛廢水的生物處理。

3 結(jié) 語

本研究以TOX作為單一碳源分離了一株編號為Q1的TOX降解菌，經(jīng)形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus），其在100 mg/L TOX的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h進入穩(wěn)定期，最佳生長pH和溫度分別為7℃和30℃，NaCl耐受度低于3%，TOX耐受度低于1200 mg/L。在對聚甲醛廢水的生物強化處理中，該菌和甲醛降解菌同時加入的處理效果要優(yōu)于其他組合，表明該生物強化菌劑消除了抑制微生物群落的主要毒性物質(zhì)，促進了聚甲醛降解微生物種群的增殖和對有毒廢水COD的有效降解，對聚甲醛廢水的處理工程具有重要的應(yīng)用價值。