雍 婕，高 晗，吳永堯，周海燕

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

甘露聚糖酶是一種被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、造紙、紡織印染、食品、飼料工業(yè)及石油開采等各個領(lǐng)域[1-6]的半纖維素酶。Man1602是本實(shí)驗(yàn)室自行篩選獲得的高活力甘露聚糖酶，同時具有很強(qiáng)的纖維素降解能力，是具有良好應(yīng)用價值的雙功能酶。為了提高M(jìn)an1602的表達(dá)量，進(jìn)一步提高其活力和穩(wěn)定性，筆者試圖揭示與Man1602功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并從分子水平對Man1602進(jìn)行改造。本研究擬分析色氨酸殘基與Man1602酶活力的關(guān)系，探討Man1602與底物結(jié)合的位點(diǎn)，旨在為尋找分子改造位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘露聚糖酶Man1602，由本實(shí)驗(yàn)室制備；二甲基（2-羥基-5-硝基芐基）溴化锍、甘油、溴酚藍(lán)、甲醇、乙酸、氨水、檸檬酸、甲醛、NaOH 和 HCl，為國產(chǎn)分析純試劑；AgNO3、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸，為Sigma公司產(chǎn)品；DNA分子標(biāo)樣及DNA片段克隆試劑盒，購自天根生化科技有限公司；QuikChange?定點(diǎn)突變試劑盒，購自MERCK公司；蛋白質(zhì)marker、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；B.subtilisWB600，購自CICIM；引物合成通過上海生工完成；測序通過上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

培養(yǎng)基配置：spA，0.4 g/dL硫酸銨，2.8 g/dL磷酸氫二鉀，1.2 g/dL磷酸二氫鉀，0.2 g/dL檸檬酸鈉；spB，0.04 g/dL硫酸鎂；100*CAYE，2 g/dL酪氨酸，10 g/dL 酵母膏；sp1，9.8 mL spA，9.8 mL spB，200 μL葡萄糖（50%，質(zhì)量體積比），200 μL 100*CAYE；sp2，5.88 mL sp1，60 μL 氯化鈣（250 mmol/L），60 μL氯化鎂（250 mmol/L）。

1.2 方法

1.2.1 酶的熒光光譜分析 使用970CRT型熒光分光光度計(jì)，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜譜寬均為5 nm，發(fā)射波長掃描范圍為250～400 nm，測定甘露聚糖酶與底物結(jié)合前后的熒光光譜變化。催化反應(yīng)底物為0.1 g/dL的葡甘聚糖，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間10 min。

1.2.2 甘露聚糖酶Man1602的色氨酸修飾反應(yīng)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，用連四硫酸鈉將甘露聚糖酶的巰基氧化保護(hù)起來，再用二甲基（2-羥基-5-硝基芐基）溴化锍特異修飾甘露聚糖酶上的吲哚基，在反應(yīng)結(jié)束后分離去除未反應(yīng)的試劑并還原SH，并測定殘余活力。反應(yīng)的緩沖系統(tǒng)為PBS pH 6.5，修飾劑最高濃度為2.5 mmol/L。

1.2.3 酶活力的測定 采用DNS法，參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，一個活力單位相當(dāng)于測定條件下每分鐘釋放出1 μmol甘露糖的酶量。

1.2.4 測定化學(xué)修飾反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，對色氨酸與酶功能的關(guān)系作初步判斷 以終濃度為3.2、10、32、100、320、1000 μmol/L 的二甲基溴化锍在 30 ℃下分別與甘露聚糖酶作用 10、20、30、40 min 后，以色氨酸終止反應(yīng)，并測定殘余酶活。然后以不加修飾劑的緩沖液作對照，計(jì)算相對酶活。相對酶活的對數(shù)對反應(yīng)時間作圖所得直線的斜率為一級反應(yīng)常數(shù)，由一級反應(yīng)常數(shù)的對數(shù)對修飾劑濃度的對數(shù)作圖，所得直線的斜率為二級反應(yīng)常數(shù)。

1.2.5 總DNA和質(zhì)粒DNA的制備 具體方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.6 目的基因的克隆、回收與純化以及與載體的連接和轉(zhuǎn)化 按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 Man1602基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 如圖1所示。用XbaI和SphI分別雙酶切目的基因，與表達(dá)載體pWB980形成粘性末端后將兩者連接。

圖1 pWB980-man表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖Fig.1 Construction spectrum of pWB980-man

1.2.8 枯草桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備 參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。適量單菌落過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于5 mL的sp1培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)5 h，達(dá)到對數(shù)生長末期，取200 μL轉(zhuǎn)接于2 mL的sp2培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min培養(yǎng) 1.5 h，加入 20 mL的 EDTA（pH 8.0），37 ℃，100 r/min培養(yǎng) 10 min，然后加入適量的重組質(zhì)粒，37℃，200 r/min培養(yǎng)1.5 h，于篩選平板培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒定。

1.2.9 甘露聚糖酶的定點(diǎn)突變的測定 參照QuikChange?定點(diǎn)突變試劑盒說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)的6對正反向引物序列分別為：

P15’-AATGAACGGCGAGCATTTCTGGTGG GGGC-3’

P25’-GCCCCCACCAGAAATGCTCGCCGTTC ATT-3’

P35’-AATGAACGGCGAGGCCTTCTGGTGG GGGC-3’

P45’-GCCCCCACCAGAAGGCCTCGCCGTTC ATT-3’

P55’-CGGCGAGTGGTTCCATTGGGGGCTGA CAG-3’

P65’-CTGTCAGCCCCCAATGGAACCACTCG CCG-3’

P75’-CGGCGAGTGGTTCGCCTGGGGGCTG ACAG-3’

P85’-CTGTCAGCCCCCAGGCGAACCACTCG CCG-3’

P95’-CGAGTGGTTCTGGCATGGGCTGACAG GCT-3’

P105’-AGCCTGTCAGCCCATGCCAGAACCA CTCG-3’

P115’-CGAGTGGTTCTGGGCCGGGCTGACA GGCT-3’

P125’-AGCCTGTCAGCCCGGCCCAGAACCA CTCG-3’

—：突變位點(diǎn)

克隆得到的突變質(zhì)粒分別為 Man（W196H）、Man（W196A）、Man（W198H）、Man（W198A）、Man（W199H）和 Man（W199A）。

1.2.10 表達(dá)產(chǎn)物的SDS電泳檢測 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，濃縮膠3 g/dL，分離膠7.5 g/dL，銀染法染色。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘露聚糖酶Man1602的熒光光譜

天然狀態(tài)Man1602的發(fā)射光譜圖顯示最大峰值位于336 nm處，光譜特征表現(xiàn)為色氨酸的特征，當(dāng)與底物結(jié)合后，光譜峰藍(lán)移至330 nm處，且熒光強(qiáng)度略增強(qiáng)（圖2），說明色氨酸是活性必需氨基酸，且位于酶蛋白分子內(nèi)部的疏水區(qū)域。

圖2 Man1602的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrogram of Man1602

2.2 色氨酸殘基的修飾反應(yīng)及其動力學(xué)

在二甲基溴化锍的修飾反應(yīng)中，當(dāng)修飾劑濃度達(dá)到最高時，酶的活力降低了近90%，可見二甲基溴化锍對該酶活性具強(qiáng)烈的抑制作用（圖3）。與底物保護(hù)組結(jié)果對比顯示加入底物對酶有良好的保護(hù)效果，酶活僅降低了不到10%。

圖3 二甲基溴化锍修飾對酶活的影響Fig.3 Effect of Dimethyl-sulfonium bromide on Man1602 activity

用不同濃度的二甲基溴化锍修飾甘露聚糖酶，一定時間后測定相對酶活，做酶反應(yīng)的動力學(xué)分析，以相對酶活的對數(shù)對時間作圖并計(jì)算一級反應(yīng)常數(shù)（圖4（a）），一級反應(yīng)常數(shù)對二甲基溴化锍濃度雙對數(shù)作圖并計(jì)算二級反應(yīng)常數(shù)（圖4（b））。

色氨酸殘基在0～20 min內(nèi)的修飾反應(yīng)過程為一級反應(yīng)階段，此階段曲線的斜率對二甲基溴化锍濃度的雙對數(shù)圖中的曲線斜率為1.98，表明該酶中有2個色氨酸為活性必需基團(tuán)。

圖4 二甲基溴化锍修飾反應(yīng)動力參數(shù)關(guān)系Fig.4 Parameters of modified reaction of Dimethylsulfonium bromide

2.3 甘露聚糖酶Man1602的定點(diǎn)突變及突變酶特性

根據(jù)Man1602氨基酸序列的比對情況來看，有3個位點(diǎn)的色氨酸具有較高的保守性，它們是W196、W198和W199。為了確定哪個是酶活性的必需氨基酸，對這3個位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，因前者和色氨酸疏水常數(shù)相近，而側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相差很大，其中同一位點(diǎn)分別突變?yōu)楸彼岷徒M氨酸；后者則為帶電性的氨基酸，可以通過比較這2種突變體，發(fā)現(xiàn)色氨酸的疏水性和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)哪個是酶活性的主導(dǎo)因素。

在重組質(zhì)粒pWB980-man中引入突變后，用XbaI和SphI進(jìn)行雙酶切，電泳檢測后送出測序，結(jié)果顯示點(diǎn)突變被成功引入（圖5）。

各種突變體都能表達(dá)分子量約40×103的目的蛋白（圖6），對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活力測定，與未引入突變的重組酶相比，196和199位的色氨酸被其他殘基取代后酶的活力幾乎喪失，而198位的色氨酸則對酶活力影響不太明顯，但是殘基疏水常數(shù)的改變可以導(dǎo)致酶活的明顯差異（圖7）。

圖5 突變體質(zhì)粒的酶切片段電泳圖及突變位點(diǎn)基因序列Fig.5 Electrophoretogram of mutant plasma digested and genic sequence of mutation site

圖6 甘露聚糖酶Man1602點(diǎn)突變體的SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE of site-directed mutant enzyme Man1602

W196和W199的突變造成Man1602活力幾乎喪失，可以推斷兩者為Man1602的活性中心氨基酸，W198雖然不會使酶完全失活，但它是保持活性中心疏水環(huán)境的重要?dú)埢?，將W198突變?yōu)锳和突變?yōu)镠所導(dǎo)致的酶活下降程度不同，丙氨酸的疏水常數(shù)與色氨酸接近，而組氨酸則為極性氨基酸，會使活性中心附近的結(jié)構(gòu)發(fā)生微小變化，造成酶活力的損失。

圖7 甘露聚糖酶Man1602突變體的活力比較Fig.7 Comparison of mutant Man1602 activity

3 結(jié) 語

色氨酸是在酶活性中心出現(xiàn)頻率較高的殘基之一，經(jīng)常作為活性中心的底物結(jié)合位點(diǎn)，在不少多糖水解酶的研究中都發(fā)現(xiàn)色氨酸與酶活密切相關(guān)[12-14]。

Man1602的熒光光譜特征表現(xiàn)為色氨酸，屬于B型蛋白，本研究中利用定點(diǎn)突變法確定W196和W199是酶活性中心的殘基，均位于分子內(nèi)部的疏水區(qū)，從改變W198位點(diǎn)的極性會使酶活力大幅度下降這一現(xiàn)象來看，活性中心周圍的疏水基團(tuán)對酶的穩(wěn)定性具有重要作用，如果將活性中心附近的極性基團(tuán)突變?yōu)槭杷鶊F(tuán)可能有利于Man1602的穩(wěn)定。

Man1602中的W196和W199與E191在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，形成酶的活性中心，此中心區(qū)域的附近還有一個絕對保守的殘基G194，與活性部位的柔性密切相關(guān)，此研究結(jié)果將另文報道。