馬玉俊，梁子敬，李 杰，王 磊，張 凱，張 康，李建喜，張景艷，馬小軍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

中藥發(fā)酵炮制是借助微生物的作用，在適當?shù)臏囟?、濕度、水分等條件下對藥物進行發(fā)酵，改變其原有的特性，增強或產(chǎn)生新的藥效，擴大應用范圍，以滿足臨床用藥的中藥炮制方法[1]。中藥發(fā)酵研究主要有對發(fā)酵工藝的優(yōu)化，發(fā)酵原理探究及其質(zhì)量標準制定等方面。目前發(fā)酵黃芪主要有單一菌種發(fā)酵和混合菌種發(fā)酵，其中單一菌種有益生菌、食用真菌、一些霉菌和鏈球菌；混合菌種主要有嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌混合，嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和青春雙岐乳桿菌聯(lián)合，乳酸菌和芽胞桿菌混合，黑曲霉和芽胞桿菌混合[2]。發(fā)酵形式有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，黃芪發(fā)酵工藝優(yōu)化，主要有單因素試驗、正交試驗、響應面優(yōu)化和其他優(yōu)化方法。但在實際研究中發(fā)酵工藝只是單獨進行，沒有相互結(jié)合，這樣不利于發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

黃芪(Radix Astragali)屬蝶形花科黃芪屬黃芪種植物，為中國常用的補氣中藥，植物來源分為蒙古黃芪和莢膜黃芪，蒙古黃芪來源于Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge. var.mongholicus(Bge) Hsia，莢膜黃芪來源于Astragalusmembranaceus(Fish.) Bge.[3]。在中國主要分布于甘肅、河北、山西、黑龍江、內(nèi)蒙古等地，以蒙古、山西、河北等地所產(chǎn)的蒙古黃芪質(zhì)量為上乘[4]。黃芪在中國屬藥食同源植物，即是藥也是食物，已經(jīng)有兩千多年歷史[5]。黃芪作為傳統(tǒng)中藥材，具有扶正補氣之功效，現(xiàn)代藥學研究表明，黃芪含有多種活性成分，包括黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮類等[6]。黃芪多糖作為一類大分子成分，包含的單糖種類主要有L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖、L-核糖、D-半乳糖、D-葡糖糖和D-甘露糖等[7]，多糖發(fā)揮著極其重要的生物功能，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤、抗動脈硬化[8]，降血糖[9]，抗病毒[10]，治療代謝性紊亂[11]，抗氧化[12]等作用，其中免疫調(diào)節(jié)功能最為突出[13]。有研究表明，生藥黃芪經(jīng)益生菌發(fā)酵后，黃芪多糖的成分顯著提高，且能提高機體免疫功能[14-15]，魏萌用芽胞桿菌發(fā)酵黃芪后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中總黃酮、總皂苷減少，黃芪多糖的量增加了[16]。朱新術(shù)等[17]用菌株FGM發(fā)酵黃芪后，產(chǎn)物粗多糖得率最可高達27.91%。但是，將益生菌FGM發(fā)酵黃芪等試驗成果轉(zhuǎn)化為大規(guī)模生產(chǎn)仍需要大量研究來優(yōu)化發(fā)酵工藝并確定工藝的穩(wěn)定性，尚利明等[21]利用篩選出來的非乳糖鏈球菌FGM應用于黃芪發(fā)酵，提取多糖，優(yōu)化發(fā)酵工藝。結(jié)果顯示在溫度39 ℃、PH為5.4、接種量5%和培養(yǎng)時間48 h的條件下多糖質(zhì)量分數(shù)最高。本試驗篩選的菌種為白蟻源堅強芽胞桿菌-CX10，具有高產(chǎn)纖維素酶特性，并且篩選因素較多，因此利用PB設(shè)計，單因素試驗和響應面法對發(fā)酵黃芪工藝進行優(yōu)化，進而為黃芪更好的開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

莢膜黃芪根購自蘭州市黃河中藥材市場；堅強芽胞桿菌-CX10(Bacillusfirms-CX10)由蘭州畜牧與獸藥研究所保存；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，3,5-二硝基水楊酸(DNS)購自雷根生物。

1.2 儀器和與設(shè)備

DFY-500型搖擺試高速中藥粉碎機(溫嶺市大機有限公司)；標準60目篩(浙江上虞市金鼎標準篩具廠)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；BIOF-6010B/G/A全自動發(fā)酵罐(上海高機生物工程公司)；LGJ-10F真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品)；酶標儀(SpectraMax○RM2e, Molecular Devices，USA)。

1.3 方 法

1.3.1 菌株復蘇與傳代 配制LB液體培養(yǎng)基，高壓滅菌備用。將凍存的堅強芽胞桿菌-CX10菌株手握復蘇，按照1%的比例，即1 mL菌液接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)復蘇的菌株繼續(xù)按照5%的比例接種到新100 mL LB液體的培養(yǎng)基中，如此傳至第4代,備用。

1.3.2 水提醇沉法提取發(fā)酵黃芪總糖 將發(fā)酵上清液4 000 r/min離心15 min，上清液放入 4 ℃保存。藥渣加入5倍體積的蒸餾水，用溫水浴法提取2 h，然后離心上清液，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)35 mL發(fā)酵液，加入100 mL 95%乙醇4 ℃靜置8 h，4 000 r/min下離心10 min，棄取上清液，用適量無水乙醇沖洗2次，用蒸餾水沖洗后置于冷凍干燥機冷凍，凍干后稱量[20]。

1.3.3 總糖和還原糖標準曲線的建立及其測定 取多糖凍干樣品100 mg，加蒸餾水溶解，定容100 mL制成1 mg/mL溶液進行測定。總糖測定用苯酚-濃H2SO4法，在OD490nm條件下測定；還原糖測定用DNS試劑法，在OD540nm條件下測定[17-18]。兩種標準曲線的建立詳見表1和表2。

以葡萄糖標準質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，OD值(Y)為縱坐標繪制總糖標準曲線，其中Y為OD在490 nm下的吸光度，求得總糖回歸方程Y=5.513 2x-0.164 6(R2=0.994 2)

表1 總糖葡萄糖標準曲線的建立Table 1 Establishment of standard curve of total glucose mL

以葡萄糖標準質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，OD值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，其中Y為OD在540 nm下的吸光度，求得還原糖回歸方程Y=4.318 1x+0.069 4(R2=0.995 8)

1.3.4 計算公式 根據(jù)測定結(jié)果用標準曲線計算樣品溶液中多糖濃度，再計算多糖質(zhì)量分數(shù)

黃芪總糖質(zhì)量分數(shù)(%)=標準曲線所得質(zhì)量濃度/(樣品質(zhì)量濃度×1 000)

黃芪還原糖質(zhì)量分數(shù)(%)=標準曲線所得質(zhì)量濃度/(樣品質(zhì)量濃度×1 000)

多糖質(zhì)量分數(shù)(%)=總糖質(zhì)量分數(shù)(%)-還原糖質(zhì)量分數(shù)(%)

表2 還原糖標準葡萄糖曲線的建立Table 2 Establishment of reducing sugar standard glucose curve mL

1.3.5 通過Plackett-Burman篩選重要變量 Plackett-Burman Design (PB)設(shè)計是選擇影響黃芪多糖生產(chǎn)的重要因素的有效手段，根據(jù)PB階乘設(shè)計，對每個因素進行兩個水平的評價，最低值和最高值分別以(-)和(+)表示。

設(shè)計基于一階線性模型，如下式所示

Y=β0+∑βiXii=1，2，3，…，K

其中Y為響應值(多糖質(zhì)量分數(shù))，b0為模型的截距，bi為線性系數(shù)，Xi獨立變量。11個因素包括化學因素有(葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl和黃芪粉)，物理因素有(溫度、pH、時間)和生物因素(接種量)，以多糖質(zhì)量分數(shù)為中心指標進行測定(表3)。所有試驗重復3次，取平均值作為響應面值。

表3 PB設(shè)計中使用的變量及其水平值Table 3 Variables and their levels employed in PB design

1.3.6 選擇上升/下降最陡的路徑 PB設(shè)計中以95%水平為顯著性因素(P<0.05)，進一步優(yōu)化使用最陡的上升/下降試驗方法。選擇的試驗上升/下降值在所選值定義的區(qū)間，這樣預計的系數(shù)比例與實際結(jié)果相符。

1.3.7 單因素篩選試驗 由于碳源(g/mL)、氮源(g/mL)、pH、接種量(%)、時間(h)和溫度(℃)都會影響發(fā)酵黃芪多糖的提取率。因此，按照連續(xù)評估的方法對上述6個因素經(jīng)行單因素試驗：在碳源添加量分別為0.40、0.60、0.80、1.00和 1.20 g/L，氮源添加量分別為3.00、5.00、7.00、9.00和11.00 g/L，pH分別為4、5、6、7、8和9，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，發(fā)酵時間分別在24、36、48、60和72 h，發(fā)酵溫度分別在27、32、37、42、47和52 ℃的條件下，進行各因素對發(fā)酵黃芪多糖的影響試驗。

1.3.8 發(fā)酵黃芪多糖的優(yōu)化試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)為響應值，選取pH(6、7、8)，接種量(7%、9%和11%)，時間(24、36和48h)和溫度(32、37和42 ℃)4個因素進行4因素3水平的BOX-Benken試驗設(shè)計(表4)，進行發(fā)酵黃芪多糖的條件優(yōu)化。

根據(jù)表5設(shè)計的各因素水平和試驗值，運用Design Expert 8.0軟件產(chǎn)生21個相關(guān)試驗，每組重復3次。運用RSM軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，根據(jù)公式擬合出非線性二次式模型

表4 響應面實驗設(shè)計中的各因素水平及實驗值Table 4 Independent variables and the experimerental value used in the reponse surface design

其中β0、βi、βii和βij分別表示常數(shù)、先行系數(shù)、二項系數(shù)和交互項回歸系數(shù)，Xi和Xj表示獨立變量。對模型進行方差分析(ANOVA)，P值和F值檢驗。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以“平均值(Mean)±標準差(SD)”表示。采用SPSS 17.0軟件中一維方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選提高發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)的工藝變量

2.1.1 PB模型設(shè)計 PB設(shè)計見表5，共11個變量，包括葡萄糖、蛋白胨、NaCl、酵母提取物、、黃芪粉、KH2PO4、溫度、pH、時間和接種量。通過12次PB設(shè)計試驗，粗多糖為評價的中心指標。各變量對多糖產(chǎn)量的主要影響估計為高水平(+1)和低水平(-1)。PB模型方差分析結(jié)果見表6。

P值為0.001 6，說明模型顯著。模型F-值為86.76，說明該模型具有顯著性。曲率F-值為 1.78，說明響應值相對于曲率不顯著。P值小于0.05的因素對響應面有顯著影響,并進一步選擇其進行優(yōu)化研究。

表5 以多糖為響應的PB變量設(shè)計Table 5 PB variable design with polysaccharide as the response

表6 PB模型方差分析Table 6 PB model variance analysis

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:* means significant difference(P<0.05);** means extremely significant difference(P<0.01).

2.1.2 相關(guān)因素的篩選 在11個被測變量中葡萄糖、蛋白胨、pH、時間、接種量、溫度、乳清粉、KH2PO4、NaCl、黃芪粉和酵母提取物對應A、B、C、D、E、F、G 、H、I、J和K，其中 A、B、C、D、E和F 顯著。乳清粉、KH2PO4、NaCl和酵母提取物對發(fā)酵黃芪多糖產(chǎn)生具有負作用，而葡萄糖、蛋白胨、pH、和時間對黃芪多糖的產(chǎn)生有正作用。對黃芪多糖的測定中不顯著影響因素為G、H、I，對應乳清粉、KH2PO4、NaCl，均被剔除。為了進一步優(yōu)化，選擇葡萄糖、蛋白胨、pH、時間、接種量和溫度進行單因素試驗。

2.1 3 單因素試驗結(jié)果 圖1-A為葡萄糖對發(fā)酵黃芪多糖的影響，隨著葡萄糖添加量增大，黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)逐漸增大，在0.80 g/L的時候，多糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值，在初始階段，葡萄糖添加量增大，細菌增殖明顯，對黃芪木質(zhì)素分解較快，多糖質(zhì)量分數(shù)增高，但隨著葡萄糖添加量進一步增大，多糖質(zhì)量分數(shù)明顯降低，后期達到穩(wěn)定狀態(tài)；圖1-B為蛋白胨對發(fā)酵黃芪多糖的影響，蛋白胨添加量在9.00 g/L的時候，多糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值，隨著添加量增大，多糖質(zhì)量分數(shù)逐漸降低。圖1-C為pH對發(fā)酵黃芪多糖的影響，有圖可知pH為7的時候，多糖質(zhì)量分數(shù)達到最大值，pH逐漸加大時，有堿性增大對細菌的增殖有一定影響，多糖質(zhì)量分數(shù)逐漸降低[16]。圖1-D為發(fā)酵時間對黃芪多糖的影響，在36 h 達到最大，隨后依次降低，細菌增殖過程中會消耗發(fā)酵產(chǎn)生的多糖；圖1-E 溫度對發(fā)酵黃芪的影響，27～ 37 ℃多糖質(zhì)量分數(shù)依次增高，但是溫度越高對細菌增殖影響越大，進而多糖質(zhì)量分數(shù)降低。圖1-F為細菌接種量對發(fā)酵黃芪的影響，在9%時多糖質(zhì)量分數(shù)達到最大，在一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基中接菌量增大，影響細菌的繁殖，代謝廢物增多影響多糖的質(zhì)量分數(shù)[17]。由于葡萄糖和蛋白胨是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)必須因素，對多糖質(zhì)量分數(shù)測定影響較大，所以在BBD模型中刪除，以pH、時間、溫度和接種量及A、B、C和D 4個因素進行響應面優(yōu)化設(shè)計。

圖1 單因素試驗Fig.1 Single factor test

2.2 響應面優(yōu)化發(fā)酵黃芪多糖

2.2.1 擬合模型和數(shù)據(jù)分析 通過對RSM的中心復合設(shè)計，進行24個試驗得到時間、pH、接種量和溫度的最佳組合。表7顯示BBD矩陣以及不同變量組合的響應值。通過對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，得到如下回歸方程。

Y=6.96+0.21A+0.42B+0.35C+ 0.15D-0.32AB-0.25AC-0.047AD- 0.28BC-0.029BD+0.093CD- 0.30A2- 0.36B2-0.30C2-0.23D2

Y為粗多糖質(zhì)量分數(shù)(%)，A、B、C、D分別為發(fā)酵pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量的編 碼值。

表7 設(shè)計模型和發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)的試驗值及預測值Table 7 Experimental design model and experimental and predicted values of fermented astragalus polysaccharide content

表8 回歸方差分析Table 8 Regression analysis of variance

2.2.2 各因素間的交互作用對多糖質(zhì)量分數(shù)影響 圖2反映不同兩因素交互作用的相應面，其中曲面越大代表二者交互作用越大[18]，通過二次多項回歸擬合方程得到最優(yōu)條件：pH為7.35、發(fā)酵時間為37.54 h、發(fā)酵溫度為37.45 ℃、接種量10.60%，預測黃芪發(fā)酵多糖最大質(zhì)量分數(shù)為 71.77%。

圖2 不同兩因素交互作用相應面Fig.2 Corresponding surface of interaction between different two factors

2.3 模型驗證

在pH為7.35、發(fā)酵時間為37.54 h、發(fā)酵溫度為37.45 ℃和接種量10.60%的優(yōu)化條件下，黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)理論值可達71.77%。為了驗證響應面所得的最佳發(fā)酵工藝的可實施性，在實際試驗條件下，以pH 7、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量10%為最佳發(fā)酵工藝，分別進行3組平行試驗，所得黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)為(69.3± 0.013)%，結(jié)果與預測值基本相符，證明該理論 有效。

3 討 論

微生物發(fā)酵可利用中藥部分成分或培養(yǎng)基為營養(yǎng)進行分裂、生長、繁殖和代謝，在生長代謝過程中分泌大量的蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等胞外酶，可使植物細胞破裂，細胞間隙增大，加快中藥有效成分的溶出，有效提高中藥有效成分的提取率[19]。 在優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)中提取物質(zhì)量分數(shù)為主要研究瓶頸。試驗設(shè)計包括對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，評價所選參數(shù)的交互作用效果，選擇最優(yōu)工藝條件。多糖質(zhì)量分數(shù)的關(guān)鍵特征是設(shè)計統(tǒng)計試驗、分析二次模型方程和評價顯著性水平[20-22]。Berhe等[23]采用CCD法和RSM法對中藥黃芪多糖生產(chǎn)的最佳條件進行評價，通過RSM方法對黃芪多糖生產(chǎn)優(yōu)化，與經(jīng)典的優(yōu)化方法相比，提高多糖的質(zhì)量分數(shù)。因此，本研究采用PB和RSM方法評估化學因素(葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl和黃芪粉)，物理因素(溫度、pH和時間)和生物因素(接種量)等變量的綜合效應。試驗中，葡萄糖、蛋白胨、pH和時間對發(fā)酵黃芪多糖的產(chǎn)生有正作用，采用統(tǒng)計試驗設(shè)計RSM篩選變量，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用組分的確切數(shù)量。Xueyong Ren等[24]采用響應面法(RSM)研究蟬擬青霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多糖(PCPS)的培養(yǎng)條件，以Plackett Burman design (PBD)對影響最大響應的因素進行篩選，然后沿著最陡的上升路徑移動到最近的響應最大區(qū)域，進行Box-Behnken設(shè)計(BBD)，優(yōu)化培養(yǎng)條件的最終水平，在優(yōu)化條件下，PCPS的最大預測產(chǎn)量為10.76 mg/g。Singh K等[25]從海洋芽胞桿菌中提取纖維素酶時，通過用RSM法優(yōu)化其培養(yǎng)基組分(木糖、牛肉提取物、pH、氯化鈉和溫度)。通過回歸模型，可以分別得到任意兩個因素以及其交叉作用發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)的響應面圖。交互項AB和BC影響顯著，而AD和BD均不顯著，可能是測定還原糖時其他糖類影響，進而影響多糖的質(zhì)量分數(shù)。

本試驗采用Design Expert 8.0軟件，通過PB模型篩選、單因素試驗和BBD響應面優(yōu)化，對葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、乳清粉、KH2PO4、NaCl、黃芪粉、溫度、pH、時間和接種量11個因素篩選和優(yōu)化，各因素對發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量分數(shù)變化的貢獻大小依次為時間>溫度>pH>接種量，其中時間和溫度交互作用最為明顯。最佳發(fā)酵工藝如下：時間為36 h、溫度為37 ℃、pH為7、接種量為10%，多糖質(zhì)量分數(shù)為(69.3±0.013)%。因此，利用多因素篩選優(yōu)化發(fā)酵黃芪使得多糖質(zhì)量分數(shù)更高。