楊亞軍，劉希望，秦 哲，李世宏，焦增華，李劍勇

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，CAS15307-79-6)作為苯乙酸類衍生物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，系非甾體解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥。雙氯芬酸鈉在歐盟已被批準(zhǔn)應(yīng)用于豬和牛，推薦劑量為2.5mg/kg，肌內(nèi)注射，推薦的治療周期為1～3d[1]。歐盟規(guī)定，在牛和豬可食性組織及牛奶中雙氯芬酸鈉的殘留標(biāo)識(shí)物為雙氯芬酸(DCF)；在牛、豬的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪和牛奶中的最大殘留限量(MRLs)分別為5、5、10、1和0.1μg/kg。歐盟制定的雙氯芬酸每日允許攝入量(acceptable daily intake， ADI)為0.5μg/kg或每人30μg[1]。在國內(nèi)，雙氯芬酸鈉也已被批準(zhǔn)用于豬，輔助用于外傷手術(shù)、炎癥等引起的疼痛和發(fā)熱[2]，同時(shí)也有應(yīng)用于奶牛臨床型乳房炎輔助治療的試驗(yàn)報(bào)道[3]；其MRLs與歐盟規(guī)定相同[2]。

目前，多采用LC-MS/MS對(duì)動(dòng)物性食品[4-6]、血漿[7]和環(huán)境樣品[8]中的DCF進(jìn)行定量檢測。由于DCF的結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基，因此可以采用電噴霧離子源負(fù)離子模式(ESI-)檢測[4-5,8]，也可以使用正離子模式(ESI+)檢測[6-7]。本研究比較兩種模式下的母離子和子離子的掃描圖譜，以及標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白肝臟加標(biāo)樣品的定量檢測結(jié)果，以期為DCF的殘留檢測方法優(yōu)化提供借鑒。

圖1 相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the analytes

1 材料與方法

1.1 試 劑

雙氯芬酸鈉，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100334-201803，含量按C14H10Cl2NNaO2計(jì) 100.0%。雙氯芬酸-(乙酰苯環(huán)-13C)鈉鹽(同位素標(biāo)記物，結(jié)構(gòu)式見圖1)，CAS：1261393-73-0，分子式13C6C8H10Cl2NO2Na·4.5H2O，相對(duì)分子質(zhì)量為405.16，Sigma-Aldrich公司，批號(hào) BCBT5244， 純度為100.0%。

乙腈，質(zhì)譜純，美國Fisher公司；甲酸，質(zhì)譜級(jí)，日本TCI公司；18 MΩ去離子水，由Direct-Q○R3純水系統(tǒng)(Millipore,USA)制備。

1.2 儀 器

液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Agilent 1200-6410A)，電噴霧離子源，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為MassHunter B.01.04 (Agilent Technologies,USA)。QUINTIX65-1CN60G型分析天平，感量0.000 01 g，sartorius；CPA224S電子分析天平，感量0.000 1 g，sartorius；Mixer-400型組織勻漿機(jī)，瑞士步琦公司；Vortex Genie 2渦旋混合器，Scientific Industries，美國；Multifuge X3R大容量低溫離心機(jī)，Thermo Scientific，美國；固相萃取裝置；RapidVap型樣品快速蒸發(fā)系統(tǒng)，美國Labconco公司；可調(diào)微量移液器，Eppendorf 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse plus C18(3.0 mm× 50 mm，1.8 μm)，乙腈-水-甲酸(60∶40∶0.1)為流動(dòng)相，等度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃。

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式或正離子模式，毛細(xì)管電壓為-3 500 V或+4 000 V；噴霧器壓力為241 kPa；干燥氣溫度為300 ℃(ESI-)或350 ℃(ESI+)；干燥氣流量(氮?dú)?為10 L/min；電子倍增器電壓增加值(ΔEMV)為 -300 V(ESI-)或+300 V(ESI+)。

1.3.2 試樣制備與保存 取適量新鮮空白牛肝臟，均質(zhì)，于-20 ℃以下貯存，備用。

1.3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在ESI-或ESI+條件下，對(duì)質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DCF標(biāo)準(zhǔn)溶液，200 μg/mL的13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，確定母離子；再行確定特征離子以及多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在ESI-或ESI+條件下，分別對(duì)DCF質(zhì)量濃度為2 ng/mL，13C-DCF質(zhì)量濃度為20 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及DCF添加量為LOQ(0.5 ng/g)，13C-DCF添加量為5 ng/g(與MRL一致)的肝臟樣品，進(jìn)行MRM檢測，進(jìn)樣量為10 μL，梯度洗脫，比較定量離子的峰面積、信噪比(SNR，峰高對(duì)峰高)，并考察方法回收率和精密度等。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

2.1.1 ESI-模式 在ESI-模式下，質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DCF標(biāo)準(zhǔn)溶液，其進(jìn)樣量為2 μL，質(zhì)量濃度為200 μg/mL的13C-DCF的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的進(jìn)樣量為1 μL。掃描范圍為m/z100～500，碎裂電壓(fragmentor)逐步優(yōu)化為20 V，母離子掃描圖見圖2。

ESI-條件下，DCF[M-H]-為294.1，13C-DCF[M-H]-為300.1。由于DCF和13C-DCF的結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)氯原子，自然界中存在35Cl和37Cl，大致比例為3∶1，因此在各自的母離子附近存在豐度比相對(duì)復(fù)雜的同位素峰。

另外，標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI-條件下進(jìn)行全掃描時(shí)，除母離子之外，均出現(xiàn)m/z相差44且豐度較高的未知離子。在對(duì)毛細(xì)管電壓、碎裂電壓和干燥氣溫度等進(jìn)行優(yōu)化后，其豐度仍然很高。

選取[M-H]-294.1和[M-H]-300.1分別作為DCF和13C-DCF的母離子，進(jìn)行子離子掃描，結(jié)果見圖3。

在DCF和13C-DCF的子離子掃描圖譜中，同樣出現(xiàn)了與母離子m/z相差44的子離子 294.1→250.1和300.1→256.1。

含有羧基的化合物可以在源內(nèi)發(fā)生裂解，成為原化合物的離子[9]。DCF和13C-DCF的結(jié)構(gòu)中均含有羧基(圖1)。因此認(rèn)為，在母離子掃描時(shí)出現(xiàn)的m/z相差44且豐度較高的未知離子，是DCF和13C-DCF的源內(nèi)裂解產(chǎn)物。

進(jìn)而確定了DCF和13C-DCF的特征離子，并優(yōu)化了多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)的參數(shù)(表1)。

2.1.2 ESI+模式 ESI+模式下，DCF和13C-DCF的母離子掃描圖見圖4，子離子掃描圖見圖5。

ESI+條件下，DCF [M+H]+為296.1，13C-DCF [M+H]+為302.1。在碎裂電壓為 75 V、干燥氣溫度為350 ℃的質(zhì)譜條件下，沒有出現(xiàn)ESI-條件下的m/z相差44的離子。進(jìn)而確定DCF和13C-DCF的特征離子，并優(yōu)化多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)的參數(shù)，結(jié)果見表2。另外，不同極性條件下DCF及13C-DCF的定量離子也有所區(qū)別(圖3和圖5)。

圖2 ESI-條件下DCF和13C-DCF的母離子掃描圖Fig.2 MS spectra of the analytes’ precursor ion under ESI-

圖3 ESI-條件下DCF和13C-DCF的子離子掃描圖Fig.3 MS/MS spectra of the analytes’ product ions under ESI-

表1 ESI-條件下MRM的檢測參數(shù)Table 1 MRM parameters under ESI-

注：*為定量離子，下同。

Note:* quantitative ion，the same below.

圖4 ESI+條件下DCF和13C-DCF的母離子掃描圖Fig.4 MS spectra of the analytes’ precursor ion under ESI+

化合物Analyte母離子Precursor ionMS1Res子離子Product ionsMS2Res駐留時(shí)間/msDwell time碎裂電壓/VFrag mentor碰撞能量/eVCollision energyDCF296.1寬 Wide215.1?標(biāo)準(zhǔn) Unit1007512寬 Wide250.1標(biāo)準(zhǔn) Unit10075813C-DCF302.1寬 Wide221.1?標(biāo)準(zhǔn) Unit1007512寬 Wide256.1標(biāo)準(zhǔn) Unit100758

2.2 MRM檢測結(jié)果的比較

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液 結(jié)果顯示，DCF質(zhì)量濃度為2 ng/mL的同一混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(圖略)，在ESI-條件下，定量離子294.1→250.1的峰面積為498；在ESI+條件下，定量離子294.1→215.1的峰面積為1 525，兩者差異較大。

2.2.2 空白加標(biāo)樣品 空白肝臟中DCF的添加量為LOQ(0.5 ng/g)，13C-DCF的添加量為5 ng/g(與肝臟MRL相同)時(shí)，ESI-和ESI+條件下，待測物及內(nèi)標(biāo)的定量離子MRM提取色譜圖分別見圖6和圖7。

圖5 ESI+條件下DCF和13C-DCF的子離子掃描圖Fig.5 MS/MS spectra of the analytes’ product ions under ESI+

圖6 ESI-條件下肝臟樣品中定量離子的提取色譜圖Fig.6 Quantitative ions extract chromatograms of liver sample under ESI-

圖7 ESI+條件下肝臟樣品中定量離子的提取色譜圖Fig.7 Quantitative ions extract chromatograms of liver sample under ESI+

如圖6和圖7所示，添加量為0.5 ng/g(LOQ)的肝臟樣品，在經(jīng)過有機(jī)溶劑提取(乙腈)、固相萃取柱凈化(Waters MAX)，以及濃縮、復(fù)溶(2 g樣品經(jīng)提取、凈化、濃縮后復(fù)溶于0.5 mL流動(dòng)相中)和過濾后，進(jìn)樣量為10 μL，梯度洗脫。同一樣品分別在優(yōu)化后的MRM條件下，進(jìn)行ESI-(圖6)和ESI+(圖7)檢測，DCF定量離子的響應(yīng)及信噪比的差異較大。ESI-時(shí)定量離子294.1→250.1幾乎沒有檢測到(圖6)；而ESI+時(shí)定量離子 296.1→215.1的SNR為5.8，可以滿足檢測。

進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，ESI+條件下，DCF添加量為0.5 ng/g(LOQ)的肝臟樣品，13C-DCF內(nèi)標(biāo)法定量，其回收率在97%～117%，日內(nèi)精密度(n=6)和日間精密度(n=18)均小于15%，滿足獸藥殘留檢測的方法學(xué)要求[10]。

3 討 論

DCF的結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基(圖1)，理論上采用ESI-和ESI+兩種模式都可以進(jìn)行檢測，文獻(xiàn)報(bào)道中也有采用ESI-和ESI+兩種模式進(jìn)行DCF定量檢測的報(bào)道。王莉等[4]、王雅琴[5]分別在負(fù)離子模式下，以萘普生為內(nèi)標(biāo)建立了豬肌肉、肝臟和腎臟中DCF的檢測方法。顧繼紅等[7]在正離子模式下，以吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)建立人血漿中DCF的檢測方法。Jedziniak等[6]建立了牛奶中多種非甾體抗炎藥物殘留的LC-MS/MS檢測方法，其中以DCF-d4為內(nèi)標(biāo)，采用正離子模式檢測DCF的殘留量。

但是本研究發(fā)現(xiàn)，在ESI-模式下DCF存在明顯的源內(nèi)裂解現(xiàn)象，導(dǎo)致MRM檢測時(shí)響應(yīng)降低，影響動(dòng)物性食品中DCF殘留檢測的靈敏度。鑒于DCF在ESI-條件下可以發(fā)生源內(nèi)裂解，建議在檢測動(dòng)物源性食品中DCF的殘留量時(shí)，采用ESI+模式。