胡帥帥，張 珉，肖葉懿，陳 陽，鮑國連，吳信生

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009；2.浙江省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

獺兔是一種重要的毛皮動物，其毛皮具有“短、平、細、密、美、牢”等優(yōu)點，被毛顏色豐富多彩，純天然的被毛不掉色或褪色，在制成服裝等制品前不需染色，不會對環(huán)境和消費者健康造成不良影響，深受消費者青睞，國內市場上天然彩色獺兔皮毛供不應求[1]。美國認可的獺兔毛色有14種，歐洲認可的有30種，而中國以青紫藍色、黑色、海貍色、白色獺兔為主。目前，國內外對獺兔毛色的研究越來越重視，在生物學及醫(yī)學領域具有重要的研究價值。

黑色素是一種生物色素，存在于動物、植物以及原生生物中。天然形成的黑色素包括真黑色素和脫黑色素(褐黑色素)，兩者比例不同導致不同顏色的形成[2]。黑色素是由黑色素細胞分泌，并通過特定的轉運方式傳送到細胞外，在相關組織中進行沉積，形成黑色素顆粒[3]。多巴是黑色素形成的前體物質，經(jīng)過一系列反應進而生成黑色素。動物的皮毛色以及植物的不同顏色都是由黑色素的種類、數(shù)量及分布情況所決定的。人類表皮中黑色素在人類的進化和生理過程中起著重要的作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在雄性和雌性鳥類中真黑色素和褐黑色素的比例不同會導致羽毛不同部位的顏色不同[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，由于黑色素的轉氨酶對性別和年齡比較敏感，導致烏骨雞母雞明顯比公雞黑[6]。

在黑色素合成過程中，黑色素合成的限速酶-酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)是不可缺少的。酪氨酸酶是黑色素合成過程中關鍵的氧化還原酶，與生物體合成色素直接相關，真黑素色和褐黑色素比例不同主要是由酪氨酸酶催化酪氨酸的反應所決定的[7]。在黑色素合成過程中，首先是黑色素細胞中酪氨酸在酪氨酸酶的催化下生成多巴，多巴經(jīng)過酪氨酸酶的進一步氧化，生成多巴醌，隨后多巴醌通過不同途徑分別生成真黑色素和褐黑色素。由于酪氨酸酶可以決定黑色素的產生，因此TYR基因的表達對黑色素的調控至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，TYR基因的多態(tài)性可顯著影響云南烏骨綿羊的毛色形成[8]，并且與家鵝羽毛色顯著相關[9]。還有研究證明，TYR基因及蛋白在棕色羊駝個體中的表達水平顯著高于白色羊駝[10]。除此之外，TYR基因在企鵝的黑色素合成及顏色形成中也發(fā)揮著至關重要的作用[11]。

毛囊是皮膚重要的附屬器官，是可再生的，具有復雜的形態(tài)和結構，由上皮組織和真皮組織組成，是毛發(fā)的加工廠。而毛發(fā)的大小和形狀是由位于毛囊底部的特殊的成纖維細胞組成的毛乳頭決定的，而毛發(fā)的顏色則是由散布在基質細胞之間的黑色素細胞產生的色素所決定的[12]。毛囊一般都是成群分布的，并且毛囊具有周期性。簡單來說，在其生長過程中，毛囊經(jīng)歷了快速生長期(生長期)、退化期以及相對“靜止期”(休止期)，其依靠上皮細胞和真皮間充質細胞的相互作用，從而完成周期性生長，發(fā)育成完整的毛囊[13]。完整的毛囊分為初級毛囊和次級毛囊。初級毛囊發(fā)生在毛囊生長的早期，其主要作用是生長粗毛。而次級毛囊發(fā)生在毛囊形成的后期，由初級毛囊分化形成，其主要生長絨毛。毛囊周期性變化對被毛的生長與脫落具有一定的調節(jié)作用[14]。毛囊發(fā)育的周期性不僅受光照、溫度及紫外線等物理因素的調控，還受相關基因及相關通路的調控。有研究發(fā)現(xiàn)，在青山羊中，表皮生長因子(EGF)基因的表達水平與次級毛囊直徑的大小顯著相關[15]。還有研究證明，BMP信號通路對初級毛囊和次級毛囊的周期發(fā)育具有顯著影響[16]。毛青青等[17]研究了BMP4對小鼠毛囊數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)干擾BMP4的表達小鼠毛囊數(shù)量會顯著增加。Alonso等[18]的研究展現(xiàn)了人和小鼠不同時期的毛囊形態(tài)特征，以及黑色素細胞的活性規(guī)律，提示毛囊數(shù)量和結構與其皮毛產量和質量有密切關系。

目前，關于動物黑色素沉積以及毛囊周期性變化的相關研究主要集中在小鼠[19]、烏骨雞[20]、貂[21]以及羊等動物中。黑色素存在于毛囊的毛乳頭及皮膚的表皮層中，有研究證明，毛乳頭中的黑色素和表皮層中的黑色素不同，前者與毛發(fā)周期緊密結合，而后者黑色素的生成是連續(xù)的[22]。在毛囊生長期，黑色素細胞亞群呈現(xiàn)不同程度的凋亡和存活[23-24]。并且還有研究證明，表皮黑色素細胞可以作為毛囊黑色素細胞參與毛囊的再生[25]。然而，在獺兔中，動物黑色素沉積和毛囊的周期變化卻鮮為人知。本試驗通過構建家兔的拔毛模型，使毛囊再生，定期采集皮膚組織，采用石蠟切片技術，在光學顯微鏡下觀察不同毛色獺兔皮膚中黑色素沉積與毛囊發(fā)育規(guī)律，分析毛囊發(fā)育周期與黑色素沉積的相關性，并分析黑色素生成的關鍵基因TYR在此期間的表達變化情況，旨在研究不同毛色成年獺兔在毛囊周期性變化過程中黑色素沉積與毛囊發(fā)育規(guī)律的相關性，為進一步探究獺兔毛色的形成機制奠定基礎，同時為培育彩色獺兔新品系和生產中獺兔科學采皮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇2月齡左右獺兔：黑色獺兔、白色獺兔、青紫藍獺兔、海貍色獺兔、蛋白青色獺兔以及蛋白黃色獺兔各3只，隨機分成6組。嚴格遵守試驗動物福利原則，將獺兔固定，隨后耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉進行麻醉，用手把靠近尾巴背部兩側的毛拔掉，所拔毛的面積大約是5 cm × 5 cm，隨后用酒精擦拭干凈，用高壓滅菌鑷子夾住皮膚，然后用剪刀慢慢剪開，剪取2 cm × 2 cm皮膚，傷口及時用碘伏處理。所剪下的皮膚分成2份：一份放入φ=4%的多聚甲醛中，用于石蠟切片制作；另一份放入-80 ℃的冰箱中保存，用于蛋白提取。以拔毛當天為第0天，試驗周期為35 d，分別在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天進行相同步驟的樣品采集。

1.2 試 劑

正丁醇、無水乙醇、二甲苯、黑色素染液試劑、中性樹膠載玻片。

1.3 石蠟切片的制作

將切片依次放入二甲苯 Ⅰ(20 min)-二甲苯 Ⅱ(20 min)-無水乙醇 Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-φ=75%的酒精(5 min)-水洗。切片浸泡到銀氨液內，加蓋放于暗處，反應12～ 18 h (4 ℃)，蒸餾水洗3遍，φ=5%的硫代硫酸鈉處理2 min，流水沖洗5 min，去除未反應的銀離子。VG染色(苦味酸-酸性品紅染色)復染。無水乙醇快洗。將切片放入二甲苯 Ⅰ(5 min)-二甲苯 Ⅱ(5 min)中脫水至透明，取出切片，晾干后選用中性樹膠進行封片。顯微鏡下觀察，黑色素、親銀細胞胞質呈黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細胞呈黃色，判讀結果。

1.4 組織蛋白的提取

取組織50～100 mg，冰上剪碎。加入預冷的RIPA 裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)0.5～1 mL。數(shù)次勻漿(玻璃勻漿器)，直至細胞破碎；冰浴10 min，與此同時，用漩渦振蕩器振蕩5 min；4 ℃ 12 000 g 離心10 min，將上清液轉至新的離心管，從而得到組織的總蛋白產物。

1.5 蛋白質量濃度的測定

取適量的25 mg/mL蛋白標準溶液，加入適量的磷酸鹽緩沖液，配制成0.5 mg/mL的蛋白標準品。按照0、1、2、4、8、12、16和20 μL，將標準品依次加入96孔板的標準品孔中，再滴加磷酸鹽緩沖液補足至20 μL。此時，標準品的質量濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 mg/mL。取20 μL制備好的不同毛色獺兔皮膚組織蛋白樣品，放入96孔板的標準品孔中。據(jù)樣品數(shù)量，配制適量BCA工作液(試劑A與試劑B體積比例為50∶1)，充分混勻，加200 μL BCA工作液到各孔中，37 ℃放置20～30 min。隨后用酶標儀測定A562處的吸光度，進行蛋白質量濃度的測定。根據(jù)各孔標準品質量濃度及所得吸光值制作標準曲線，并根據(jù)樣品體積計算出不同樣品的蛋白質量濃度。

1.6 Wes 全自動蛋白表達分析試驗

取出Wes Separation 12～230 ku 8×25 capillary cartridges試劑盒中的Standard Pack 1試劑置于冰上；向含有白色 dTT 粉末的指型管內加入 40 μL 去離子水，吹打均勻，即為dTT溶液；向裝有粉色Master mix粉末的透明管內加入 20 μL dTT溶液和20 μL 10×Sample buffer，不斷吹打至均勻，即為5×Master mix；白色管內加入16 μL離子水、2 μL dTT 溶液和2 μL 10×Sample buffer，吹打均勻，吸出10 μL左右放到空的 0.6 mL管內待變性； 1個孔需要5 μL樣品(加入Master Mix的)，為了防止變性時的蒸發(fā)，建議 1 個孔配 1.5 個孔的量，假設樣品濃度為y，配制1個孔所需體積量如表1所示；一抗用 Antibody diluent Ⅱ稀釋后放在冰上待用；二抗即開即用，無需配制；取Lumino-S 和 Peroxide 各150 μL配制發(fā)光液，渦旋振蕩混合，放在冰上待用；隨后將配制好的試劑依次加入板內，試驗完成后分析 結果。

表1 每孔上樣量Table 1 Loading quantity of samples per well

2 結果與分析

2.1 拔毛后不同毛色獺兔皮膚毛囊的再生情況

為了觀察不同毛色獺兔皮膚組織不同時期毛囊在皮膚中的位置分布情況，通過石蠟切片技術，利用黑色素染色方法進行染色，通過光學顯微鏡對切片進行觀察。結果發(fā)現(xiàn)，不同毛色獺兔的毛囊均分布在皮膚組織的真皮層中，由于毛囊處在不同時期，所以不同毛色獺兔皮膚中不同時間點的毛囊深度均不同。彩色獺兔毛囊周期在35 d左右。7～21 d，毛囊處于生長期，此階段毛囊結構完整，并且清晰可見初級毛囊和次級毛囊。 21～28 d，毛囊由生長期進入退化期，毛囊不完整，毛干開始脫落，毛囊深度變淺。35 d左右時，毛囊處于休止期，毛囊群結構松散，并且初級毛囊和次級毛囊數(shù)量減少，形態(tài)模糊(圖1，圖2)。

2.2 拔毛后不同毛色獺兔皮膚黑色素生成分析

使用黑色素染色方法進行切片染色，結果發(fā)現(xiàn)在不同時期，不同毛色獺兔皮膚組織黑色素含量變化趨勢均一致，7 ～21 d逐漸增多，28～35 d逐漸減少。結果表明，不同毛色獺兔皮膚中黑色素沉積量均在第21天達到最高(圖2)。

2.3 拔毛后不同毛色獺兔皮膚TYR蛋白表達水平分析

已知TYR是動物體黑色素細胞中黑色素合成的限速酶，該基因的表達對黑色素含量有一定的調控作用。根據(jù)“2.1”和“2.2”的研究結果，選取拔毛后第7天、第21天、第35天3個時間點，利用Wes 全自動蛋白表達分析儀，檢測TYR蛋白在不同毛色獺兔皮膚組織的蛋白表達水平。使用GAPDH作為內參抗體進行蛋白定量分析。結果表明(圖3)，TYR蛋白在不同時期不同毛色的皮膚組織中均有表達，且均在第21天表達水平最高，3個時間點表達量差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

WH.白色 White; BL.黑色 Black; BR.海貍色 Beaver color; CH.青紫藍色 Cyan blue; PY.蛋白黃色 Protein yellow; PC.蛋白青色 Protein cyan;▲表示毛囊中黑色素顆粒 Melanin particles in the hair follicle.下同 The same below

圖1 不同時期不同毛色獺兔皮膚組織石蠟切片縱切結果(40×)
Fig.1 Results of longitudinal paraffin sectioning of rabbits with different skin colors in different periods (40×)

圖2 不同時期不同毛色獺兔皮膚組織石蠟切片橫切結果(200×)Fig.2 Results of horizontal paraffin sectioning of skin tissue of rabbits with different coat color in different periods (200×)

圖3 不同時期不同毛色皮膚組織TYR蛋白的相對表達量Fig.3 Statistics of relative expression ratio of TYR protein of skin tissues of different hair colors in different periods

3 討 論

不同類別哺乳動物的毛囊發(fā)育均具有周期性，并且周期性變化是不同的。有研究證明，小鼠毛囊發(fā)育的生長期可分為0～8個階段。從0階段的誘導生長開始，在1階段促進毛芽(胎盤)生長，在2階段，表皮毛發(fā)生殖細胞開始增殖，隨后在3～8階段，毛囊方向確定以及毛干形成、生長[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，彩色獺兔毛囊周期在35 d左右，大體上來講，從第7～21天，毛囊處于生長期階段；第21～28天，毛干開始逐漸脫落，毛囊由生長期進入退化期。到第35天時，毛囊結構不清晰，初級毛囊和次級毛囊模糊，毛囊處于休止期。張 藝[26]探究大鼠毛囊的生長周期，發(fā)現(xiàn)大鼠的毛囊生長周期為28 d，其中1～18 d為生長期， 19～22 d為退化期，23～28 d為靜止期。本研究結果與大鼠毛囊生長周期基本一致。

黑色素分布于表皮層和毛囊中，但主要集中分布于毛囊中。黑色素含量及種類不同對不同毛色的形成具有重要影響。有研究發(fā)現(xiàn)，毛囊群越密集，其周圍黑色素細胞越多，進而生成的黑色素含量越高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，獺兔皮膚中黑色素含量7 d～21 d逐漸增多，從第28天開始，到第35天逐漸減少。說明黑色素含量隨著毛囊同期的變化而變化。有研究表明，在小鼠毛囊的生長初期和中期，其黑色素含量高于毛囊生長末期，與本文研究結果一致。在毛囊處于生長期時，黑色素沉積量相對較高，隨著毛干的脫落，黑色素含量逐漸 減少。

酪氨酸酶是動物體內黑色素細胞產生黑色素過程中的限制酶。本研究中，在毛囊再生的第21天，即毛囊處于生長期時，TYR蛋白的相對表達水平高于第7天和第35天。趙兵令等[28]通過檢測小鼠不同生長周期的黑色素含量，并且根據(jù)蛋白免疫印跡分析了黑色素相關蛋白MITF、TYR及TYRP2等的相對表對水平，發(fā)現(xiàn)在毛囊的生長初期和中期其黑色素含量及蛋白相關表達水平高于毛囊生長末期。與本研究結果基本一致。本研究結果中黑色素沉積量在第 21 天最高，與TYR蛋白的相對表達水平一致。

4 結 論

在不同毛色獺兔的皮膚組織中，毛囊均分布在皮膚組織的真皮層中，且不同時期毛囊深淺不一，拔毛后， 7 ～21 d，毛囊處于生長期； 21～ 28 d，毛囊由生長期進入退化期，28～35 d毛干逐漸脫落，在第35天左右毛囊處于休止期。不同毛色獺兔皮膚組織在不同時期黑色素含量不同，均在第21天黑色素含量沉積達到最高，第28～35天沉積量逐漸減少。在拔毛后第21天，黑色素合成的限速酶TYR蛋白在不同毛色獺兔皮膚中蛋白表達水平均最高，與黑色素沉積情況一致。