白義鳳 胡洪林 鄧穎 劉宇

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腫瘤中心（成都610071）

膠質(zhì)瘤是最常見顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的47.1%，也是神經(jīng)系統(tǒng)最棘手的難治性腫瘤之一［1］。目前膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放化療為主，但由于膠質(zhì)瘤呈彌漫性生長，做不到完全切除，且對放化療敏感性差，因此患者的預(yù)后差，中位生存期不足2年，5年生存率僅9.8%，治療后復(fù)發(fā)率幾近100%，目前臨床上缺乏有效的早期診斷及臨床療效及預(yù)后評估指標(biāo)［2-3］，尋求調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展的靶向分子、開發(fā)更為有效的治療藥物及早期診斷及臨床預(yù)后生物標(biāo)志物是目前膠質(zhì)瘤臨床治療中亟待解決的難題。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種新型的具有獨(dú)特性質(zhì)的非編碼RNA，它不具有5′端帽子和3′端尾巴，是以共價(jià)鍵形成的閉合環(huán)狀分子［4］。circRNA對RNA 外切酶的降解具有抗性，因此具有比線性RNA 更高的生物穩(wěn)定性。研究［5］表明，circRNA 在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥等病理生理過程。此外，眾多研究證實(shí)，circRNA 在腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達(dá)量差異顯著，且相關(guān)circRNA 表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的惡性程度及侵襲性具有相關(guān)性［6］。然而關(guān)于circ0008016 在膠質(zhì)瘤中的作用及機(jī)制目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道，本研究擬進(jìn)一步研究circ0008016 在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年1月1日至2018年12月30日于我院確診的膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本92 例，同時(shí)收集33 例腦外傷患者的正常腦組織標(biāo)本作為對照組。依據(jù)2007年WHO 分級對所有樣本進(jìn)行病理分級（其中Ⅰ級膠質(zhì)瘤12 例；Ⅱ級29 例；Ⅲ級24 例；Ⅳ級27 例）。80 例患者接受了替莫唑胺（TMZ）化療，其中32 例患者對化療敏感［化療后腫瘤部分或完全緩解（PR 或CR）］，48 例患者化療耐藥［化療后出現(xiàn)進(jìn)展或疾病穩(wěn)定（PR 或SD）］。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療以及其他中藥免疫治療。所有組織標(biāo)本在手術(shù)切除后立即保存于2 mL 無菌凍存管并立即投至液氮中速凍。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。所有患者術(shù)后均進(jìn)行了隨訪。隨訪起點(diǎn)為手術(shù)或病理活檢日，末次隨訪時(shí)間為2019年5月1日，隨訪時(shí)間5 ～49個(gè)月，中位隨訪時(shí)間36個(gè)月，至隨訪截止日，存活病例30例，死亡病例59例，3 例失訪。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87 及正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞HEB 均來自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)至6 孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到70%匯合時(shí)，按分組LipofectamineTM2000 和OPTI-MEM I（Invitrogen）將si-circ0008016 表達(dá)載體和si-NC 空載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，每組均設(shè)陰性對照，轉(zhuǎn)染后24 和48 h，提取細(xì)胞總RNA 備用，并用G418篩選單克隆建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.4 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，接種于96 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)2.0 ×103細(xì)胞∕孔，每孔體積200 μL，分別于0、12、24、36、48、72 h，每孔加入CCK8 溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育0.5 ～4 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm 的各孔吸光度（A），以時(shí)間為橫軸，吸光度（A）為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。每次設(shè)3 個(gè)平行孔，至少重復(fù)2 次。

1.5 Real-time PCR 檢測circ0008016 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平采用TRIzol 方法提取組織標(biāo)本中總RNA。將提取的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μL 體系中加2 μg總RNA 進(jìn)行cDNA 的合成。Real-time PCR 采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA 作為摸板，引物濃度0.4 μmol∕L，15 μL 體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測樣本設(shè)置3 個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以GAPDH 作為內(nèi)參照。PCR 反應(yīng)在定量PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行。3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行定量分析。

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡變化Annexin V∕PI 染色法。對數(shù)生長期的細(xì)胞以4×105∕孔接種于6 孔板中；將si-circ0008016 和si-NC 轉(zhuǎn)入細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次；細(xì)胞重懸 于100 μL 含Annexin V-FITC 和0.5 μg PI 的結(jié)合緩沖液（10 mmol∕L HEPES pH 7.4，0.15 mol∕L NaCl，5 mmol∕L KCl，1 mmol∕L MgCl2，1.8 mmol∕L CaCl2）中；避光室溫孵育15 min；加入400 μL 結(jié)合緩沖液；流式細(xì)胞儀分析，按下列公式計(jì)算細(xì)胞的凋亡指數(shù)：細(xì)胞凋亡指數(shù)=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）∕總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 CCK8 法檢測藥物敏感性實(shí)驗(yàn)以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后，參照替莫唑胺化療藥物的臨床血漿高峰濃度，在各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別加入0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 倍臨床血漿高峰濃度的化療藥物，每種藥物的每一濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔；陰性對照組：僅加細(xì)胞不加藥物，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔；空白調(diào)零組：僅加細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，每孔加新鮮配制的CCK8 溶液10 μL，37 ℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀上選擇450 nm 波長測定各孔吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞在不同濃度下的3 種化療藥物的存活率：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度均值-空白對照組吸光度均值）∕（陰性對照組吸光度均值-空白對照組吸光度均值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次求平均值，以細(xì)胞存活率為縱軸，藥物濃度對數(shù)為橫軸作半對數(shù)圖，并按作圖法計(jì)算出3 種藥物的IC50值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示。circ0008016在組織及細(xì)胞中的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)分析。circ0008016 與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square 檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法分析circ0008016 的表達(dá)與生存時(shí)間及預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用單因素及Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的因素，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ0008016 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中的表達(dá)采用QRT-PCR 檢測circ0008016 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ0008016在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87 中的表達(dá)明顯高于正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞HEB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A）。circ0008016 在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腦組織標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）；隨著膠質(zhì)瘤分級的增加，circ0008016 的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1C）；此外，circ0008016 在替莫唑胺耐藥患者中的表達(dá)較替莫唑胺敏感患者明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1D）。

圖1 QRT-PCR 檢測circ0008016 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中的表達(dá)Fig.1 QRT-PCR was used to detect the expression of circ0008016 in glioma cells and tissues

2.2 膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中circ0008016 的表達(dá)意義根據(jù)circ0008016 的平均表達(dá)水平，將膠質(zhì)瘤患者分為circ0008016 高表達(dá)組（circ0008016≥9.530）52 例及低表達(dá)組（circ0008016＜9.530）40 例，分析circ0008016 的表達(dá)與患者臨床預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ0008016 的表達(dá)與腫瘤WHO 分級、化療敏感性及生存狀態(tài)明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 circ0008016 的表達(dá)對膠質(zhì)瘤患者生存的影響采用Kaplan-Meier 法評估患者的生存時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與低高表達(dá)circ0008016 的患者比較，高表達(dá)circ0008016 的患者的總生存時(shí)間及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2A、2B。

表1 Circ0008016 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者中病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship of circ0008016 and the pathological features in glioma 例

2.4 circ0008016 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響進(jìn)一步分析circ0008016 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染si-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-circ0008016 后能明顯降低細(xì)胞中circ0008016 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3A），下調(diào)circ0008016的表達(dá)后能抑制細(xì)胞的增殖（圖3B），促進(jìn)細(xì)胞對化療藥物的敏感性（圖3C）。

2.5 單因素及多因素分析影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素單因素分析發(fā)現(xiàn)circ0008016 的表達(dá)、WHO臨床分級、對替莫唑胺的敏感性是影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的因素。多因素分析發(fā)現(xiàn)circ0008016 的表達(dá)、WHO 臨床分級是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見表2。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，國內(nèi)報(bào)道約占顱內(nèi)腫瘤的35% ～60%。其中，惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為（5 ～8）∕100 萬，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第3 位［7-8］。腦膠質(zhì)瘤可發(fā)生于任何年齡，成人患者平均發(fā)病年齡為40 歲，在10 歲左右兒童中亦有一個(gè)發(fā)病小高峰［9］。2008年世衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，腦膠質(zhì)瘤是34 歲以下腫瘤患者的第2 順位死亡原因。由于腦膠質(zhì)瘤侵襲性強(qiáng)、治療棘手，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前尚無有效的治療手段［10-11］。因此，闡明其發(fā)病機(jī)制以尋找有效的治療手段一直是一個(gè)亟待解決的難題。

圖2 circ0008016 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（A）及總生存時(shí)間（B）的關(guān)系Fig.2 The relationship between circ0008016 expression and the recurence free survival time（RFS）and overall survival time（OS）in glioma patients

圖3 circ0008016 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響Fig.3 Effects of circ0008016 on proliferation and chemosensitivity of glioma cells

表2 影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素Tab.2 Prognostic factors of glioma patients

circRNA 是一類新的具有多種調(diào)控功能的非編碼RNA，自1991年起，環(huán)狀RNA 就開始有報(bào)道，但一直沒有深入的研究［12］。2012年，SALZMANN等原先打算檢測兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中的基因外顯子錯(cuò)排，卻意外發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在腫瘤和非腫瘤細(xì)胞中廣泛存在。環(huán)狀RNA 是在轉(zhuǎn)錄后，由前體mRNA 的反向剪接（backsplicing）形成，前體mRNA 的下游的剪接供體（downstream splice donor）的3′端與上游的剪接受體（upstream splice acceptor）的5′端共價(jià)結(jié)合形成的環(huán)狀RNA 分子。由于是閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏RNA 酶的作用位點(diǎn)，環(huán)狀RNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［13-14］。并且circRNA 含miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，通過堿基互補(bǔ)配對原則海綿樣吸附相關(guān)miRNA，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)［15］，在調(diào)控腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［16-17］。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在腫瘤細(xì)胞與正常組織有不同的表達(dá)模式與表達(dá)水平，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，環(huán)狀RNA 有可能成為多種腫瘤的治療靶點(diǎn)［18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)circ_0001730 通過miR-326∕Wnt7B 環(huán)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。EIF4A3 誘導(dǎo)環(huán)狀RNA MMP9（circ MMP9）作為海綿吸附mir-124，促進(jìn)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生［20］。circPCMTD1 通過海綿吸附miR-224-5p 促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展［21］。課題組前期通過circRNA 芯片發(fā)現(xiàn)circ0008016 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）組織中高表達(dá)，circ0008016 轉(zhuǎn)錄自第8 號染色體上的FGFR1 基因（chr8：38287199-38287466，NM_001174064），生物信息結(jié)合信號通路串分析發(fā)現(xiàn)circ0008016 與EGF 之間存在潛在作用關(guān)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)circ0008016在膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的高表達(dá)；circ0008016 在高級別的膠質(zhì)瘤患者明顯高表達(dá)，與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)；circ0008016 的表達(dá)與患者的腫瘤WHO分級、化療敏感性及生存狀態(tài)明顯相關(guān)。YANG等［22］研究發(fā)現(xiàn)Circ-FBXW7 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的總生存時(shí)間正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)circ0008016 的患者的總生存時(shí)間及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間較低表達(dá)者明顯縮短。QIU 等［23］研究發(fā)現(xiàn)circ_0079593 通過海綿吸附miR-182 與miR-433 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲，與患者的預(yù)后差相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)circ0008016 的表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞對化療藥物的敏感性。單因素及COX 多因素回歸模型分析提示，circ0008016的表達(dá)、WHO 分級是膠質(zhì)瘤患者獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究首次發(fā)現(xiàn)circ0008016 在膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本中高表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)，可作為潛在的膠質(zhì)瘤早期診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。然而影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的因素復(fù)雜多樣，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)深入研究。