急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于持續(xù)性和嚴(yán)重缺血引起的心肌組織急性壞死[1]。AMI是發(fā)病率最高的心血管疾病之一，其死亡率和致殘率極高，嚴(yán)重威脅病人生命及生活質(zhì)量。及時(shí)診斷對(duì)于控制AMI的發(fā)展、給予適當(dāng)治療、降低死亡率、改善預(yù)后至關(guān)重要。目前，心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等常規(guī)生物標(biāo)志物被廣泛用于臨床診斷，但診斷特異性有限[2]。尋找敏感性、特異性較高的AMI新型診斷標(biāo)志物具有積極臨床意義。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，基于核苷酸的生物標(biāo)志物在疾病診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值受到關(guān)注。大量研究表明，微小RNA(miRNA)在多種生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，且其在組織中的異常表達(dá)導(dǎo)致各種疾病，如癌癥和心血管疾病[3-4]。另外，miRNA在外周血或血漿中非常穩(wěn)定且容易檢測(cè)[5]。這些特點(diǎn)表明miRNA可作為AMI診斷的潛在生物標(biāo)志物。本研究旨在評(píng)估AMI病人外周血miR-486、miR-150水平，確定miR-486、miR-150是否可以作為AMI早期診斷的新型生物標(biāo)志物，探討外周血miR-486、miR-150水平與AMI疾病類(lèi)型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4月—2017年8月重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的AMI病人136例作為研究對(duì)象。年齡(58.53±12.01)歲；男78例，女58例。其中80例被診斷為ST段抬高型心肌梗死(STEMI組)，56例被診斷為非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI組)。AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)：①急性缺血性胸痛；②心電圖異常(病理性Q波，ST段抬高或抑制)；③心肌壞死標(biāo)記物[肌鈣蛋白(cTn)和肌酸激酶(CK)]的水平超過(guò)正常范圍上限的兩倍。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有病人均符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)；②病人癥狀出現(xiàn)后24 h內(nèi)入院；③無(wú)心肌梗死或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)史；④所有病人臨床病例資料均完整；⑤所有病人及其家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴血液學(xué)疾?。虎诎榧毙曰蚵愿腥?；③伴肝功能不全、腎衰竭；④惡性腫瘤病史。另選擇同期于本院體檢的健康成年志愿者(心電圖正常，無(wú)心血管疾病史)100名作為對(duì)照組，其中男64名，女36名；年齡(58.37±11.54)歲。

1.2 標(biāo)本采集 抽取病人入院及健康者體檢時(shí)的靜脈血樣本5 mL，置于EDTA抗凝管中，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，分離上清液，并于4 ℃，12 000 r/min，離心10 min。收集血漿，置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取 采用miRNeasy Serum/P；asm試劑盒(北京Qiagen公司)，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)從血漿中提取總RNA。將RNA溶于20 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水中。采用NanoDrop2000c分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)測(cè)定RNA樣品的濃度和質(zhì)量。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 采用TaqMan人微小RNA測(cè)定試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-486和miR-150表達(dá)水平。將血漿樣品RNA濃度稀釋至180 ng/μL。15 μL RT反應(yīng)體系：100 mM dNTPs 0.3 μL，MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)3 μL，10×RT緩沖液1.5 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)0.19 μL，RT引物6 μL，RNA樣品3 μL，無(wú)核酸酶水1.01 μL。將試劑混合物置于16 ℃孵育30 min、42 ℃孵育30 min、85 ℃孵育5 min，RT產(chǎn)物置于-20 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。20 μL PCR反應(yīng)體系：20×TaqMan MicroRNAassays 1.0 μL，RT產(chǎn)物0.16 μL，TaqMan Universal Master Mix Ⅱ 10 μL，No AmpErase UNG(2×)，無(wú)核酸酶水8.84 μL。PCR循環(huán)由95 ℃ 10 min初始變性、95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s的40個(gè)循環(huán)兩部分組成。以U6 snRNA作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參考。每個(gè)樣本測(cè)量一式3份。miRNA的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 3組臨床資料比較 3組年齡、性別、高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙及體格檢查指標(biāo)等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、CK-MB、心肌特異性肌鈣蛋白(cTnT)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 3組臨床資料比較

注：TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，HDL為高密度脂蛋白，LDL為低密度脂蛋白，BUN為尿素氮；1 mmHg=0.133 kPa

2.2 兩組外周血miR-486、miR-150表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，AMI組病人外周血miR-486、miR-150水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

組別例數(shù)miR-486miR-150AMI組1361.78±0.171.47±0.16對(duì)照組1001.03±0.021.02±0.03t值43.87127.754P0.0000.000

2.3 外周血miR-186和miR-150表達(dá)水平對(duì)AMI的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-486和miR-150在AMI早期階段表現(xiàn)出對(duì)AMI組病人與對(duì)照組之間的強(qiáng)區(qū)分能力。miR-486對(duì)AMI病人診斷的AUC為0.732(P<0.001)，敏感性為0.564，特異性為0.848；miR-150對(duì)AMI病人診斷的AUC為0.681(P<0.001)，敏感性為0.516，特異性為0.793。詳見(jiàn)圖1。

圖1 外周血miR-486和miR-150對(duì)AMI診斷的ROC曲線分析

2.4 STEMI和NSTEMI病人miR-486、miR-150表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，STEMI和NSTEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。STEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均高于NSTEMI病人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

組別例數(shù)miR-486miR-150STEMI組801.81±0.191.51±0.16NSTEMI組561.73±0.171.42±0.15對(duì)照組100 1.03±0.021.02±0.03t1-2,P2.522,0.0133.312,0.001t1-3,P40.799,0.00029.993,0.000t2-3,P40.777,0.00025.822,0.000

注：t1-2為STEMI vs NSTEMI；t1-3為STEMI vs 對(duì)照組；t2-3為NSTEMI vs 對(duì)照組

2.5 外周血miR-186和miR-150表達(dá)水平對(duì)STEMI的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-486和miR-150對(duì)STEMI組與對(duì)照組有較高區(qū)分能力。miR-486對(duì)STEMI病人診斷的AUC為0.701(P<0.001)，敏感性為0.574，特異性為0.798。miR-150對(duì)STEMI病人診斷的AUC為0.641(P<0.001)，敏感性為0.794，特異性為0.429。詳見(jiàn)圖2。

圖2 外周血miR-486和miR-150對(duì)STEMI診斷的ROC曲線分析

2.6 外周血miR-486和miR-150表達(dá)水平對(duì)NSTEMI的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-486和miR-150對(duì)NSTEMI組與對(duì)照組有較高區(qū)分能力。miR-486對(duì)NSTEMI病人診斷的AUC為0.785(P<0.001)，敏感性為0.674，特異性為0.835。miR-150對(duì)NSTEMI病人診斷的AUC為0.736(P<0.001)，敏感性為0.819，特異性為0.577。詳見(jiàn)圖3。

圖3 外周血miR-486和miR-150對(duì)NSTEMI診斷的ROC曲線分析

3 討 論

AMI是臨床上常見(jiàn)的心腦血管疾病。由于其發(fā)病突然、進(jìn)展迅速、死亡率高，已成為目前威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一[6]。早期發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確診斷和靶向治療對(duì)AMI病人的預(yù)后改善具有重要臨床意義。臨床研究表明，AMI發(fā)病初期沒(méi)有明顯臨床癥狀，只有50%的病人心電圖(ECG)異常[7]。cTnT作為AMI早期臨床診斷常用的外周血標(biāo)志物，具有較高特異性和敏感性。然而，研究表明，在急性和慢性腎衰病人中也觀察到cTnT表達(dá)的升高。因此，探尋更具體的血清標(biāo)志物對(duì)AMI的臨床診斷具有重要價(jià)值。

miRNA是小的非編碼RNA，其長(zhǎng)度為17～27個(gè)核苷酸。miRNA能夠與目標(biāo)mRNA的3′UTR配對(duì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯抑制、靶標(biāo)降解或基因沉默，從而發(fā)揮基因表達(dá)序列特異性調(diào)節(jié)因子的作用[8]。研究表明，miRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，包括增殖、分化、發(fā)育和凋亡等[9]。研究證實(shí)，miRNA的異常表達(dá)與包括AMI在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是許多疾病發(fā)病機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)因子[10]。miRNA可以被細(xì)胞輸出或釋放至血液中，在外周血或血漿中非常穩(wěn)定且容易檢測(cè)到。另外，miRNA具有組織特異性，在特定病理?xiàng)l件下，外周血miRNA的水平也存在差異。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，外周血miRNA可以作為各種疾病診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，尤其在心血管疾病的診斷中具有較好的應(yīng)用前景[11]。然而，關(guān)于AMI病人中外周血miRNA表達(dá)的研究仍十分有限。miR-486是肌肉中富含的一種miRNA，是心肌/骨骼肌中的一種有效調(diào)節(jié)因子，在杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和去神經(jīng)支配誘導(dǎo)的肌肉萎縮等幾種肌肉疾病中下調(diào)[12]。miR-486過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致肌肉肥大。研究表明，AMI病人外周血miR-486表達(dá)上調(diào)可能與心肌肥厚有關(guān)[13]。miR-150是一種與炎癥有關(guān)的miRNA，與各種心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[14]。血漿樣品的微陣列篩選結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈高壓病人miR-150水平顯著低于健康對(duì)照者，且血漿miR-150水平是肺動(dòng)脈高壓病人生存期的有效預(yù)測(cè)因子[15]。在不穩(wěn)定型心絞痛病人血清中也觀察到miR-150表達(dá)的異常，且對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛的診斷準(zhǔn)確率較高[16]。研究表明，miR-150可能通過(guò)直接抑制心肌細(xì)胞中的促凋亡基因egr2和p2x7r來(lái)抑制缺血性損傷期間心臟的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)[17]。

有研究通過(guò)對(duì)AMI病人和健康對(duì)照者進(jìn)行血漿miRNA微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，AMI病人中miR-486和miR-150的表達(dá)水平發(fā)生變化[18]。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，AMI組血漿miR-486和miR-150水平均高于對(duì)照組，提示miR-486和miR-150的上調(diào)可能是AMI發(fā)病的原因之一。進(jìn)一步ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-486和miR-150對(duì)AMI診斷的AUC分別為0.732、0.681，且表現(xiàn)出對(duì)AMI組與對(duì)照組的強(qiáng)區(qū)分能力，提示外周血miR-486和miR-150對(duì)AMI的診斷具有較高診斷價(jià)值，且miR-486的診斷價(jià)值更優(yōu)。

根據(jù)心電圖(ECG)變化可將AMI病人分為STEMI組和NSTEMI組。其中，STEMI病人主要癥狀在于梗死相關(guān)動(dòng)脈被纖維蛋白血塊閉塞，及時(shí)給予再灌注治療是最有效的方法[19]。而NSTEMI病人主要癥狀在于梗死相關(guān)動(dòng)脈部分被富含血小板的血塊阻塞，及時(shí)給予初始保守策略或初始侵入策略即可有效改善病人病情[20]。因此，AMI的準(zhǔn)確診斷對(duì)控制病情進(jìn)展、選擇適當(dāng)治療方式、降低死亡率、改善預(yù)后至關(guān)重要。雖然ECG作為臨床上AMI診斷及疾病類(lèi)型鑒別的常用工具，具有較高診斷價(jià)值，然而，由于NSTEMI病人往往缺乏典型癥狀，心電圖中ST段也會(huì)出現(xiàn)明顯升高現(xiàn)象，檢測(cè)易出現(xiàn)誤診。尋找敏感性、特異性較高的AMI疾病類(lèi)型鑒別診斷標(biāo)志物，對(duì)疾病的靶向治療具有積極臨床意義。

本研究分析STEMI病人和NSTEMI病人外周血miR-486和miR-150水平發(fā)現(xiàn)，STEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均高于NSTEMI病人，提示外周血miR-486和miR-150水平可能與特定類(lèi)型的AMI相關(guān)。進(jìn)一步采用ROC曲線分析顯示miR-486和miR-150對(duì)STEMI組或NSTEMI組與對(duì)照組之間有強(qiáng)區(qū)分能力，且miR-486診斷STEMI病人和NSTEMI病人的AUC分別為0.701、0.785，miR-150診斷STEMI病人和NSTEMI病人的AUC分別為0.641、0.736，提示miR-486和miR-150對(duì)STEMI和NSTEMI病人的鑒別均具有較高診斷價(jià)值，且對(duì)NSTEMI病人的診斷價(jià)值更優(yōu)。

綜上所述，AMI病人外周血miR-486和miR-150水平顯著升高，對(duì)AMI的診斷具有較高診斷價(jià)值，且miR-486和miR-150水平在STEMI和NSTEMI病人中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)STEMI和NSTEMI的診斷具有一定價(jià)值，miR-486和miR-150可能是診斷AMI的合適生物標(biāo)志物。