田立平, 邢峰杰, 王曉波

(濰坊市市政公用事業(yè)管理處，山東濰坊261041)

與傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法、濾膜法相比，采用酶底物法檢測(cè)總大腸菌群具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)等行業(yè)。酶底物法和濾膜法、多管發(fā)酵法對(duì)總大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果具有一致性，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[1-4]。筆者結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)酶底物法檢測(cè)總大腸菌群過(guò)程中的質(zhì)量控制因素進(jìn)行了研究，以期為今后的工作提供參考與支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

科立得試劑、97孔定量盤(pán)、97孔陽(yáng)性比色盤(pán)、程控定量封口機(jī)、DHP-9080電熱恒溫培養(yǎng)箱。

實(shí)驗(yàn)室用水：采用MilliPore純水系統(tǒng)制備純水，經(jīng)平皿計(jì)數(shù)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)符合實(shí)驗(yàn)要求。使用時(shí)用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，制成無(wú)菌水。

1.2 樣品來(lái)源

濰坊市峽山水庫(kù)地表水、濰坊市某地區(qū)地下水、濰坊市中心市區(qū)管網(wǎng)水以及飲用水總大腸菌群質(zhì)控標(biāo)樣(批號(hào)為022718-1和021518)。

1.3 檢測(cè)方法

根據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T 5750.12—2006)中的酶底物法和《城鎮(zhèn)污水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(CJ//T 51—2018)中的酶底物法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

在采用酶底物法檢測(cè)飲用水總大腸菌群過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的質(zhì)量控制硬件主要包括電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、立式高壓蒸汽滅菌器以及培養(yǎng)基等。在電熱恒溫培養(yǎng)箱和冰箱的使用過(guò)程中，采用檢定合格的溫度記錄儀測(cè)定溫度，控制箱內(nèi)溫度與設(shè)定溫度差在±0.5 ℃內(nèi)；定期用化學(xué)指示卡或者生物滅菌指示劑，檢測(cè)立式壓力蒸汽滅菌器的滅菌效果；培養(yǎng)基例如科立得試劑在使用前，進(jìn)行大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)和無(wú)菌性測(cè)試。質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)值為91±12 MPN/100 mL，從表1可以看出驗(yàn)證合格。軟件方面影響因素主要包括檢測(cè)時(shí)間、取樣容器、培養(yǎng)時(shí)間以及檢測(cè)環(huán)境等。影響因素中的生物實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，例如純水、培養(yǎng)基等。

表1 科立得試劑符合性驗(yàn)證 MPN·100 mL-1

2.1 檢測(cè)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

微生物樣品所規(guī)定的保存時(shí)間為4 h[5]，但實(shí)際工作中會(huì)存在因外出取樣路程太遠(yuǎn)等情況，不能在4 h內(nèi)及時(shí)檢測(cè)。針對(duì)全年溫度變化，采用實(shí)際水樣和質(zhì)控樣品對(duì)冬天(4 ℃)、春秋(20 ℃)以及夏天(35 ℃)取樣運(yùn)輸過(guò)程中保存時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響進(jìn)行分析。

2.1.1 實(shí)際水樣

采用無(wú)菌水對(duì)污水出廠水按一定比例稀釋、混勻，配制得到試驗(yàn)水樣。對(duì)同一水樣，在不同保存溫度和時(shí)間下的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。20和35 ℃條件下水樣保存2 h后，結(jié)果變化很大；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)果呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化；4 ℃下冷藏保存24 h內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，而24 h后呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化。

圖1 檢測(cè)時(shí)間對(duì)實(shí)際水樣總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的影響

2.1.2 總大腸菌群質(zhì)控樣品

用已滅菌的管網(wǎng)水將總大腸菌群質(zhì)控樣稀釋10倍，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)值為9.1±1.2 MPN/100mL，可接受范圍為2.9～28.4 MPN/100mL。從圖2可以看出，在4 h內(nèi)對(duì)4，20和35 ℃下保存水樣的檢測(cè)結(jié)果比較穩(wěn)定。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，20和35 ℃下保存的水樣的檢測(cè)結(jié)果顯著變化，4 ℃冷藏條件下的水樣在24 h內(nèi)結(jié)果變化不大，且隨后均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 檢測(cè)時(shí)間對(duì)總大腸菌群質(zhì)控樣檢測(cè)結(jié)果的影響

2.2 取樣容器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

目前常用的微生物取樣容器有玻璃瓶、無(wú)菌塑料瓶、無(wú)菌采集袋等，而微生物具有吸附性，存放過(guò)程中不同的容器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響程度可能存在差別。采用生活飲用水管網(wǎng)水、地表水、地下水、質(zhì)控樣品共4類11個(gè)樣品對(duì)這3種容器分別進(jìn)行試驗(yàn)，其中質(zhì)控樣品批號(hào)為022718-1，用已滅菌的實(shí)際水樣稀釋10倍，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)SPSS軟件配對(duì)t檢驗(yàn)分析，p>0.05，3種容器的檢測(cè)結(jié)果不存在顯著差異。

表2 取樣容器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 MPN·100 mL-1

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

對(duì)總大腸菌群質(zhì)控樣品(標(biāo)準(zhǔn)值為91±12 MPN/100mL)進(jìn)行酶底物法檢測(cè)，不同培養(yǎng)時(shí)間后的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)22～28 h后的檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)值附近，用SPSS軟件分析表明，培養(yǎng)15～21、29～33 h后的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)要求的24 h相比均有顯著性差異，因此檢測(cè)總大腸菌群最佳的培養(yǎng)時(shí)間為22～28 h。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.4 檢測(cè)環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

取生活飲用水管網(wǎng)水、地表水、地下水和總大腸菌群質(zhì)控樣品4類水樣，其中總大腸菌群質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)值為214±17 MPN/100 mL，可接受度范圍為69～668 MPN/100 mL。對(duì)每類樣品分別在無(wú)菌環(huán)境和非無(wú)菌潔凈室條件下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)SPSS軟件配對(duì)t檢驗(yàn)分析p>0.05，4類水樣7個(gè)樣品在無(wú)菌環(huán)境和非無(wú)菌潔凈室下的檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，酶底物法檢測(cè)總大腸菌群對(duì)檢測(cè)環(huán)境無(wú)嚴(yán)格要求。

表3 不同檢測(cè)環(huán)境下的總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果 MPN·100 mL-1

3 結(jié)論

① 微生物樣品采集后若不能在4 h內(nèi)完成總大腸菌群的檢測(cè)，須立即置于4 ℃冷藏保存，并在24 h內(nèi)完成檢測(cè)，在夏季高溫和春秋季取樣時(shí)要特別注意。

② 取樣采用玻璃瓶、塑料瓶和采集袋，對(duì)總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的影響程度無(wú)顯著差異。但考慮到塑料瓶和采集袋易破損等因素，建議首先選擇硬質(zhì)玻璃瓶取樣。塑料瓶和采集袋為一次性無(wú)菌取樣容器，可在應(yīng)急樣品取樣或大批量的取樣缺乏足夠滅菌玻璃瓶的情況下使用。

③ 采用酶底物法檢測(cè)總大腸菌群，培養(yǎng)時(shí)間宜控制在22～28 h。該方法對(duì)所處環(huán)境是否無(wú)菌無(wú)嚴(yán)格要求，可以應(yīng)用于室外應(yīng)急檢測(cè)工作。