趙宏宇,王 玉,劉新宇,宋蓮蓮,史頂聰,邸 琳

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林長春 130012)

林蛙油為中國林蛙輸卵管干制品,我國自宋朝時期就有使用林蛙油的記載,是珍貴的保健品。林蛙油味甘咸、性平、歸腎、肺經(jīng),具有益精補腎、滋陰潤肺的功效[1]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明,林蛙油在抗疲勞、抗氧化、抗衰老、增強免疫力方面有一定的功效[2-5],女性使用后在改善圍絕經(jīng)期癥狀方面有很好的效果[6-7]。林蛙油在改善女性健康方面的作用很可能來自于其提升雌激素的作用,在林蛙油治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的報道中[8],患者雖然未能提高骨密度,但血清雌二醇含量卻提升了1倍。很多動物實驗也報道服用林蛙油后,動物血清雌二醇含量顯著上升[9-10]。關(guān)于林蛙油提升血清雌激素的作用機制,目前主流觀點認為是外源性地攝入了林蛙油中的雌激素,從而提升了服用者體內(nèi)的雌激素含量。目前通過液相色譜法檢測到林蛙油中雌二醇含量大約在3～7.65 μg/g[11-12],因林蛙油產(chǎn)地差異和雌二醇提取方式不同,林蛙油中雌二醇含量有一定差異。但關(guān)于外源激素制備大鼠高雌激素血癥模型的研究[13-14]表明,大鼠長時間每日肌肉注射苯甲酸雌二醇1000 μg/kg以上,顯著性提高大鼠血清雌二醇含量。根據(jù)林蛙油中雌二醇含量推算,大鼠灌胃大劑量林蛙油獲得的雌二醇不足2 μg/kg,而且與肌肉注射相比,雌二醇通過口服途徑效力會進一步降低。從外源激素機制考慮,林蛙油中的雌二醇不足以將服用者血清雌二醇含量顯著提升。因此推測林蛙油提升服用者的血清雌激素,不是單純依靠外源攝入林蛙油中的雌激素,而是有作用于性腺軸中“垂體-卵巢”部分的內(nèi)源途徑。為驗證這一推測,設(shè)計了本次實驗,同時灌胃大劑量林蛙油給正常大鼠和去卵巢大鼠,觀察性激素和卵巢、子宮的組織學(xué)變化,希望通過本研究初步了解林蛙油提升服用者血清雌激素的機制是否基于調(diào)節(jié)服用者卵巢功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WISTRA雌性大鼠(實驗動物質(zhì)量合格證號:NO.201800020868,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)-2016-0003,60只,體質(zhì)量200～230 g) 長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司,由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物倫理委員會審核通過,符合實驗動物倫理委員會規(guī)定;林蛙油 購于吉林省白山市,經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院邸琳主任藥師鑒定為中國林蛙(Rana temporaria chensinesis David)雌蛙輸卵管干制品;雌二醇、孕酮、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮、泌乳素測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法) 鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

Smatr3000型科斯邁全自動化學(xué)發(fā)光免疫儀 重慶科斯邁生物科技有限公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HC-3618R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;JA2003B型千分之一電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;Y-2000型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠;九陽L18-Y928型攪拌機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物去勢模型制備及分組 雌性WISTAR大鼠隨機選取20只分為2組,分別為正常對照組和正常+林蛙油組。其余大鼠,以戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉,肋骨下沿至骨盆上沿位置除毛備皮,碘伏消毒,在距離肋骨下沿2 cm,距離脊柱2 cm的脊柱兩側(cè),分別切開1 cm大小皮膚層切口,從皮膚切口下操作,切開小于1 cm的腹腔壁肌肉層切口,切口視野達到腹腔,拉出卵巢脂肪團,結(jié)扎卵巢與子宮連接部,摘除雙側(cè)卵巢,腹腔壁肌肉層和皮膚層分層縫合,消毒傷口。術(shù)后及連續(xù)3 d,肌注青霉素(4×104U/kg),以防感染。術(shù)后大鼠飼養(yǎng)15 d,選取傷口完全愈合、體重增長、外觀狀態(tài)良好的20只大鼠隨機分為兩組,分別為去勢對照組和去勢+林蛙油組。

1.2.2 林蛙油灌胃溶液的制備及給藥 林蛙油在水中泡發(fā)后膨脹度大于55,且其高濃度的水溶液呈果凍狀[15],不處理難以灌胃,吳朝霞等[16]研究發(fā)現(xiàn)以豆油作為溶劑溶解林蛙油粉末,可將林蛙油灌胃劑量提高10～20倍,但考慮到林蛙油古文記載的療效和多數(shù)的科學(xué)研究中食用方法是以水泡發(fā),因此仍然選擇以水作為溶劑。每日稱取林蛙油2～2.2 g置于100倍蒸餾水中4 ℃下泡發(fā)16 h,灌胃前攪拌機充分攪拌至可用灌胃器輕松吸取。正常+林蛙油組和去勢+林蛙油組每日按20 mL/kg灌胃林蛙油水溶液,林蛙油灌胃劑量等于200 mg(生藥)/kg,劑量換算相當于人每日服用2 g林蛙油。正常對照組和去勢對照組每日灌胃同等體積的蒸餾水。連續(xù)灌胃4周。

1.2.3 動物處理及檢測指標 大鼠末次灌胃1 h后以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,3000 r/min離心1 min分離血清備用;摘取子宮和卵巢(正常對照組和正常+林蛙油組的卵巢),稱量器官濕重,計算器官指數(shù);子宮和卵巢4%多聚甲醛固定,制作石蠟切片HE染色,400倍顯微鏡下進行組織切片檢查;使用試劑盒,利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)、泌乳素(PRL)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 服用林蛙油對大鼠血清雌二醇、孕酮、促黃體生成素、促卵泡生成素、睪酮、泌乳素含量的影響

結(jié)果如表1所示,血清雌二醇方面,與正常對照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清雌二醇含量顯著上升(P<0.05),去勢對照組大鼠血清雌二醇含量顯著降低(P<0.05),與去勢對照組相比,去勢大鼠+林蛙油血清雌二醇含量無顯著變化(P>0.05);血清孕酮方面,與正常對照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清孕酮含量有一定上升趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),去勢大鼠血清孕酮含量顯著降低(P<0.05),與去勢對照組相比,去勢大鼠+林蛙油血清孕酮含量無顯著變化(P>0.05);血清促黃體生成素方面,正常+林蛙油組和去勢+林蛙油大鼠組血清促黃體生成素含量都有一點下降的趨勢,但各組間大鼠血清促黃體生成素含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);血清促卵泡生成素方面,與正常對照組相比,去勢大鼠血清促卵泡生成素含量有一定下降趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),正常大鼠和去勢大鼠+林蛙油后,血清促卵泡生成素含量有一定下降趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);血清睪酮方面,與正常對照組相比,服用林蛙油的正常大鼠血清睪酮含量顯著上升(P<0.05),去勢大鼠血清睪酮含量顯著降低(P<0.05),與去勢對照組相比,去勢+林蛙油大鼠的血清睪酮含量顯著上升(P<0.05);泌乳素方面,與去勢對照組相比,去勢大鼠+林蛙油的血清泌乳素含量顯著上升(P<0.05),其它各組間大鼠血清泌乳素含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清性激素含量Table 1 Content of serum sex hormone in all

注:*表示正常+林蛙油組、去勢對照組與正常對照組比較，差異顯著,P<0.05;#表示去勢+林蛙油組與去勢對照組比較，差異顯著,P<0.05;表2、表3同。

表2 各組大鼠子宮、卵巢濕重及器官指數(shù)Table 2 The wet weight and organ index of ovary and uterus in all

雌二醇和孕酮的結(jié)果表明,服用林蛙油確實有提升正常大鼠血清雌激素的作用,但提升的機制應(yīng)不同于外源雌激素機制,而考慮與卵巢功能調(diào)節(jié)相關(guān)。促黃體生成素和促卵泡生成素的結(jié)果表明,服用林蛙油后,正常大鼠和去勢大鼠的兩種促卵巢激素都出現(xiàn)受抑制的趨勢,提示林蛙油中可能存在類似的促激素物質(zhì)。睪酮和泌乳素的結(jié)果表明,服用林蛙油能提升正常大鼠和去勢大鼠血清睪酮和泌乳素,考慮到去勢大鼠服用后也有提升效果,這種作用方式可能類似外源激素,但本實驗主要研究血清雌激素提升機制,因此沒有繼續(xù)考察。

2.2 服用林蛙油對大鼠子宮、卵巢濕重及器官指數(shù)的影響

結(jié)果如表2所示,去勢后的大鼠子宮嚴重萎縮,濕重和子宮指數(shù)都顯著低于正常對照組(P<0.05)。正常大鼠服用林蛙油后,子宮和卵巢的濕重和器官指數(shù)并沒有發(fā)生明顯的變化(P>0.05)。去勢大鼠+林蛙油組的大鼠子宮濕重呈現(xiàn)出一定的增長趨勢,但與去勢對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

大鼠若長期給予外源雌激素以致機體內(nèi)雌激素顯著性升高情況下,子宮作為雌激素受體器官,一般會出現(xiàn)子宮指數(shù)的增加,而卵巢作為雌激素的分泌器官,功能受抑制,一般會出現(xiàn)卵巢指數(shù)降低[17-18]。本實驗中,正常大鼠服用林蛙油后血清雌二醇顯著上升,但各器官指數(shù)卻沒有顯著的變化,并不符合使用外源雌激素的結(jié)果。

2.3 服用林蛙油對大鼠子宮、卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響

如圖1所示,正常對照組、正常+林蛙油組大鼠子宮粘膜上皮為單層柱狀上皮,其下可見部分腺體,粘膜層內(nèi)可見少許嗜酸性粒細胞,肌層為平滑肌細胞,外膜光滑。服用林蛙油后,組織形態(tài)無明顯變化,子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度間比較也無顯著差異(P>0.05),見表3;去勢對照組大鼠子宮萎縮,體積變小,鏡下可見子宮內(nèi)膜呈單層立方上皮,腺體數(shù)量減少未見分泌,子宮間質(zhì)萎縮,細胞稀疏;去勢+林蛙油組大鼠子宮萎縮,體積變小,但相比于去勢對照組,子宮內(nèi)膜細胞層次增加,子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度增加,子宮內(nèi)腺體數(shù)量增加,腺體內(nèi)腺細胞數(shù)量和細胞厚度增加,子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度間比較有明顯差異(P<0.05),見表3。

組別子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度(μm)正常對照組29.29±4.59正常+林蛙油組27.06±5.79去勢對照組13.69±2.93去勢+林蛙油組 20.16±6.66#

正常大鼠在服用林蛙油前后,子宮組織病理學(xué)檢查中并沒有出現(xiàn)明顯的變化,子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度沒有顯著性的改變。在去勢大鼠方面,由于沒有了自身動情周期雌激素波動的影響,子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度增加更直接反映外源雌激素的作用[19],而且結(jié)合組織病理學(xué)檢查,子宮的組織結(jié)構(gòu)改善也支持林蛙油有一定外源雌激素的作用,但綜合血清雌激素檢測和子宮指數(shù)基結(jié)果,考慮林蛙油有較低的外源雌激素作用,但不足以提升機體的血清雌激素含量。

如圖2所示,正常對照組大鼠卵巢切片鏡下可見卵巢表面被覆薄層結(jié)締組織膜,皮質(zhì)內(nèi)可見不同發(fā)育階段的各級卵泡及黃體,卵泡周圍為纖維結(jié)締組織間質(zhì),髓質(zhì)內(nèi)可見大血管;正常+林蛙油組大鼠卵巢切片鏡下與正常對照組接近,但觀察到卵巢內(nèi)黃體數(shù)量多于正常大鼠組卵巢中黃體數(shù)量。

圖2 林蛙油對正常大鼠卵巢組織病理學(xué)的影響(400×)Fig.2 Effect of RO on ovary pathohistology of normal rats(400×)注:箭頭所指分別為卵泡和新生成的黃體。

卵巢中卵泡排卵后形成黃體,黃體會大量分泌雌二醇和孕酮[20]。正常大鼠服用林蛙油后,組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)卵巢中黃體增多,與大鼠服用林蛙油后血清雌二醇、孕酮含量升高的實驗結(jié)果相互支持,提示林蛙油確實有作用于性腺軸中“垂體-卵巢”部分的內(nèi)源途徑來提升機體雌激素。

3 討論

大鼠血清雌二醇(E2)含量隨著動情周期波動,一般在動情間期最低,在動情前期和動情期達到最高水平,而血清孕酮(P)含量一般在動情后期達到最高[21]。促黃體生成素(LH)是以腦垂體脈沖式分泌的方式進入血液,所以測定人類血清LH需在1 h內(nèi)多次取血混合,以減小誤差[22],本研究選擇一次性的采血方式,LH的含量可能存在一定誤差。本研究中所有大鼠同一天處理采集血清,并未統(tǒng)一所有大鼠處于相同的動情周期,在實際檢測結(jié)果中,不論是否服用林蛙油,正常大鼠組內(nèi)不同大鼠血清E2和P含量差異很明顯,考慮可能處于不同動情周期。但同時發(fā)現(xiàn),相比于正常對照組,正常+林蛙油組大鼠組內(nèi)大鼠血清E2和P含量差異更大,這里推測正常大鼠服用林蛙油后,動情期時血清E2和P含量要升高更多。未來需進一步結(jié)合動情期考察,研究林蛙油提升雌激素機制以驗證以上推測。

在本研究中,正常大鼠服用林蛙油后,卵巢組織病理學(xué)檢查中觀察到了較多排卵后黃體,康嵐等[9]研究發(fā)現(xiàn),服用林蛙油后大鼠卵巢中閉鎖卵泡增多。一般在一個動情周期中,卵巢中會有很多卵泡生長發(fā)育,但只有數(shù)個卵泡能成熟、排卵,轉(zhuǎn)變成黃體,其它未成熟的卵泡一般會在之前的階段就停止發(fā)育,最終形成閉鎖卵泡[23]?？梢酝茰y,服用林蛙油后,促使或激活了更多的卵泡生長發(fā)育,進而成熟的卵泡和閉鎖的卵泡相應(yīng)增多,成熟的卵泡增多導(dǎo)致排卵增多同時生成的黃體數(shù)目也增多了,而過多的卵泡和黃體都導(dǎo)致血清P和E2的含量明顯上升。但是這個推測中林蛙油中起到這個作用的物質(zhì)并不清楚,結(jié)合大鼠血清LH和促卵泡生成素(FSH)含量都有一定降低趨勢,林蛙油促卵泡功能物質(zhì)應(yīng)不是作用于下丘腦和垂體,而是直接作用于卵巢,且不是LH、FSH的激素,曾考慮一種已用于促排卵藥的物質(zhì)-絨毛膜促性腺激素(HCG),陳曉平等[24]檢測林蛙油中HCG含量達到了107.5 μg/g,1 g林蛙油中的HCG含量接近于1個HCG國際單位,但此劑量不足以達到促卵泡發(fā)育的作用。林蛙油是雌性林蛙的排卵前膨大的輸卵管,由于林蛙是兩棲動物,且其繁育后代是將未受精的卵排到水中,進行體外受精,輸卵管中的物質(zhì)此刻將作為包裹受精卵的物質(zhì),作為提供卵子發(fā)育成熟乃至受精卵發(fā)育的環(huán)境物質(zhì)[25],其中具有某些促卵泡發(fā)育的激素是一個比較合理的推測,或許因為兩棲動物和哺乳動物物種不同,促性腺激素的結(jié)構(gòu)有一定差異,并沒有被檢測出,但在服用者體內(nèi)可以發(fā)揮作用?？傮w而言,想要明確物質(zhì)基礎(chǔ)難度較大,沒有足夠的證據(jù)能證實這個推測,需要進一步的研究探索。

林蛙油的安全性一直是大家關(guān)心的問題[26]。外源雌激素改變內(nèi)分泌會使年輕女性皮膚狀態(tài)更好,使更年期女性圍絕經(jīng)期綜合征癥狀改善,但同時患子宮肌瘤甚至宮頸癌等婦科疾病概率也會增加[27-28]。服用林蛙油一直被認為是補充外源雌激素,因此林蛙油是否有外源雌激素同樣的安全性問題也是很多實驗室的關(guān)注點。有研究發(fā)現(xiàn)[12],小鼠長期服用林蛙油后,子宮組織中的TβR-I、TβR-II(和子宮內(nèi)膜癌相關(guān))的表達并沒有顯著變化,反而卵巢組織中的FSHR(和卵巢早衰、卵巢癌相關(guān))表達增高,該研究結(jié)果與本研究的推測相符,服用林蛙油更多是刺激卵巢功能。研究林蛙油安全性問題,建議關(guān)注其對卵巢的過度刺激及卵巢早衰。

4 結(jié)論

本研究中正常大鼠服用林蛙油后,血清E2和T含量顯著升高,子宮組織檢查未觀察到顯著變化,卵巢組織觀察到黃體增多。去勢大鼠服用林蛙油后血清E2含量無明顯變化,T和RPL含量顯著升高,子宮組織檢查中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細胞厚度顯著增加,且子宮細胞層次狀態(tài)有改善。綜上考慮林蛙油提升服用者雌激素機制可能類似促性腺激素刺激卵巢中卵泡發(fā)育,同時也具有一定的外源激素作用。