,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長(zhǎng)春 130000;2.通化百泉保健食品有限公司,吉林通化 134000)

紅參(Red ginseng)是人參(Panaxginseng)蒸制之后的熟制品,主要功效成分為人參皂苷,具有提高機(jī)體免疫力、預(yù)防炎癥、抗氧化、防衰老、抗腫瘤等生物活性[1]。紅景天(Rhodiolarosea)為景天科紅景天屬草本或亞灌木植物,屬傳統(tǒng)藥用植物，有養(yǎng)心、補(bǔ)腎、平喘等功效。紅景天苷為紅景天的主要生物活性成分,在抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等方面具有顯著作用,其藥理作用得到廣泛關(guān)注[2]。大棗(Ziziphusjujuba)含有豐富的蛋白質(zhì)、糖分、礦物質(zhì)和氨基酸等,具有降低膽固醇、抑制癌細(xì)胞增殖、養(yǎng)血安神等功效[3]。

隨著社會(huì)科技的發(fā)展,激烈的競(jìng)爭(zhēng)使得人們生活不規(guī)律導(dǎo)致自身機(jī)體免疫力下降，食用功能性食品提升免疫力成為了大部分人的選擇。目前以傳統(tǒng)食物和中草藥為載體的提高免疫力的保健產(chǎn)品較為缺乏，所以開發(fā)一款具有提高免疫力功效的保健產(chǎn)品具有很高的意義和價(jià)值。

本試驗(yàn)以紅參為原料,配以紅景天和大棗提升產(chǎn)品功效及口感,研發(fā)一款具有提高免疫力功效的功能性飲品,結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)品保健功效的基礎(chǔ)探究，以期為紅參和紅景天的深加工開辟新的產(chǎn)品領(lǐng)域,豐富加工品種,從而促進(jìn)紅參食品發(fā)展,提高人民健康水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅參、紅景天 百草大藥房;大棗汁(100 mL大棗汁含紅棗原料100 g)、白砂糖 市售;皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶試劑盒(LDH) 南京建成生物工程研究所;甲醇、香草醛、無(wú)水乙醇、硫酸、乙醚、正丁醇、醋酸鉛、硫酸鈉、生理鹽水 均為分析純;雄性昆明小鼠(SPF級(jí)18～22 g) 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào)(SCXK(遼)2015-0001)。

JY92-II型超聲波細(xì)胞破碎儀 杰靈儀器制造(天津)有限公司;BE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司;HX1002T型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LXJ-IIB大容量多孔離心機(jī) 鹽城凱特試驗(yàn)儀器公司;354型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司;D-5L型高壓均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Phd科技公司。

1.2 紅參提取液制備

紅參經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩,稱取5 g紅參粉,加入適當(dāng)倍數(shù)液料比的水為提取溶劑,在室溫下浸泡2 h后,放入超聲波細(xì)胞破碎儀中,按照一定的超聲功率和超聲時(shí)間進(jìn)行提取,提取結(jié)束后4000 r/min離心20 min。將得到的上清液濃縮至1∶1(100 mL提取液含紅參原料100 g)后備用。

1.3 紅景天提取液制備

紅景天經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80目篩子后按液料比40∶1 mL/g,超聲功率300 W,超聲時(shí)間30 min的條件進(jìn)行超聲波提取后將提取液濃縮至1∶1(100 mL提取液含紅景天原料100 g)備用。

1.4 紅參提取液提取工藝優(yōu)化

1.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考王玉堂[4]的方法稍作修改,在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),以人參總皂苷含量為響應(yīng)值,優(yōu)化提取工藝參數(shù)。紅參提取液經(jīng)濃縮(100 mL提取液含紅參原料100 g)后備用。因素水平表如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level table of response surface test

1.4.2 人參總皂苷含量測(cè)定 參照GB/T 19056及陳振[5]的方法稍作修改,以Re為標(biāo)準(zhǔn)品,制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.0478x+0.0097,決定系數(shù)R2為0.9953,線性關(guān)系良好。人參總皂苷含量按公式計(jì)算:

式中:X-人參總皂苷含量(%);CONC-通過(guò)回歸方程計(jì)算出的供試品質(zhì)量(μg);V1-定容體積(mL);V2-取樣體積(μL);m-供試品稱樣量(mg)。

1.5 產(chǎn)品加工工藝

紅參提取液、紅景天提取液、大棗汁、白砂糖→調(diào)配→均質(zhì)→裝瓶密封→殺菌→冷卻→成品

將上述原輔料按一定比例混合后在300 MPa的條件下循環(huán)均質(zhì)2次,于100 mL玻璃瓶灌裝,121 ℃條件下殺菌15 min。

1.6 產(chǎn)品配方最佳參數(shù)優(yōu)化

1.6.1 產(chǎn)品配方響應(yīng)面優(yōu)化 為了確保本產(chǎn)品提高免疫力的功能,并賦予其良好口感,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以感官品質(zhì)評(píng)分為響應(yīng)值,因素水平表如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factor and level table of response surface test

1.6.2 產(chǎn)品感官評(píng)價(jià) 根據(jù)林曉琳[6]、Han等[7]的方法稍作修改,隨機(jī)選取10名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的評(píng)定人員組成評(píng)定小組,以感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(表3)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表3 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(分)Table 3 Criteria for sensory evaluation(score)

1.7 產(chǎn)品提高免疫力試驗(yàn)

1.7.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及計(jì)量設(shè)計(jì) 按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》方法[8],將48只小鼠隨機(jī)分6組:空白組(蒸餾水)、高劑量組(人體推薦量40倍)、中劑量組(人體推薦量20倍)、低劑量組(人體推薦量10倍)、紅參提取液組、紅景天提取液組。紅參-紅景天功能飲品的人體推薦量為每人每天100 mL(衛(wèi)生部規(guī)定每人每天人參攝入量≤3 g,綜合配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及本產(chǎn)品規(guī)格設(shè)計(jì)選擇100 mL/瓶為推薦量)。紅參、紅景天提取液組按產(chǎn)品中劑量40 mL/kg[9]給藥?；A(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)7 d,每日灌胃一次,連續(xù)30 d后斷糧給水24 h后頸椎處死,對(duì)其臟器指數(shù)(胸腺/體重、脾臟/體重)、細(xì)胞免疫功能(遲發(fā)型病態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)-耳腫脹程度)、NK細(xì)胞活性(乳酸脫氫酶活性)進(jìn)行測(cè)定。

1.7.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.7.2.1 臟器指數(shù) 處死前稱量小鼠體重,解刨取出胸腺及脾臟并稱重,按下列公式計(jì)算[10]:

1.7.2.2 細(xì)胞免疫功能測(cè)定 遲發(fā)型病態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)-耳腫脹程度。灌胃第25 d將每只鼠腹部用脫毛膏脫毛約4 cm×4 cm,用50 μL DNCB溶液均勻涂抹到脫毛處致敏,5 d后用10 μL DNCB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩側(cè),24 h后處死小鼠剪下左右耳殼,用打孔器取下直徑6 mm的圓片并稱重[11],按下列公式計(jì)算耳腫脹率:

1.7.2.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定 小鼠眼球取血后立即將血液4000 r/min離心10 min得到血清,并按乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[12]。乳酸脫氫酶活性按下列公式進(jìn)行計(jì)算:

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取工藝方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅參提取液提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4,各因素?cái)M合得到回歸方程為:Y=-4.77800+0.053750A-0.087500B-0.041250C+0.38750AB+0.030000AC+0.38250BC-3.23611E-0.11650A2-0.71900B2+0.018500C2。回歸方程方差分析見表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

由表5可知,此模型中P<0.01,表示該模型極顯著;失擬項(xiàng)為0.9969>0.05不顯著,表示非試驗(yàn)因素對(duì)此試驗(yàn)影響不大;R2為0.9922,表明試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際情況擬合度較高。綜上所述,該模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)各試驗(yàn)條件對(duì)人參總皂苷含量的影響。將上述方程求解獲得最佳的理論工藝參數(shù):超聲功率272.13 W,液料比32.29∶1 mL/g,超聲時(shí)間32 min。理論預(yù)測(cè)值:4.96%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為超聲功率270 W,液料比32∶1 mL/g,超聲時(shí)間32 min。驗(yàn)證試驗(yàn):總皂苷含量4.96%±0.53%,RSD值為0.53%,與預(yù)測(cè)結(jié)果接近,表明該工藝穩(wěn)定可靠,可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

2.2 產(chǎn)品最佳配方確定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表6,各因素?cái)M合得到回歸方程為:Y=93.60000+2.75000A+0.58333B-1.16667C-1.83333D+4.44089E-016AB+0.75000AC+2.50000AD-0.50000BC+0.25000BD+0.75000CD-5.21667A2-5.96667B2-2.34167C2-2.59167D2?；貧w方程方差分析見表7。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of response surface test

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

表8 產(chǎn)品對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 8 Effect of product on organ index in mice

注:與空白組相比較,*表示顯著(P<0.05),**表示極顯著(P<0.01)。表9、表10同。

由表7可以看出,整體模型P<0.01,失擬項(xiàng)為0.2118,R2為0.9847表明該模型與實(shí)際情況擬合較好。將上述方程求解得到最佳的理論參數(shù)為紅參提取液1.89%、紅景天提取液1.53%、大棗汁3.11%、白砂糖5.98%,感官評(píng)分預(yù)值值結(jié)果為94.29。綜合回歸模型的預(yù)測(cè)和實(shí)際生產(chǎn)考慮最終確定最佳的配方參數(shù):紅參提取液2%、紅景天提取液1.5%、紅棗汁3%、白砂糖6%,感官評(píng)分為94，與預(yù)測(cè)值接近，表明該配方可行。

2.3 產(chǎn)品提高免疫力功能評(píng)價(jià)結(jié)果分析

2.3.1 臟器指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果 由表8可知,產(chǎn)品組及提取液組的胸腺與脾臟指數(shù)均有提高。與空白組相比,中、高劑量組和紅景天提取液組胸腺指數(shù)差異性顯著(P<0.05),中劑量組差異極顯著(P<0.01)，產(chǎn)品的中、高劑量組和紅參提取液組脾臟指數(shù)差異性顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重均高于空白組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此試驗(yàn)結(jié)果與孫帆[13]的結(jié)果相似,因?yàn)樾叵俸推⒆鳛槊庖咂鞴倏芍庇^地反映健康狀況,所以本產(chǎn)品有提高免疫力的功效。

2.3.2 細(xì)胞免疫功能測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果 由表9可知,實(shí)驗(yàn)組的耳腫脹程度均高于空白組,其中與空白組相比,產(chǎn)品高劑量組和紅參提取液組差異顯著(P<0.05),中劑量組差異極顯著(P<0.01),由此可以證明本產(chǎn)品對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能有顯著性提高。

表9 產(chǎn)品對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響Table 9 Effect of product on cellular immune function in mice

2.3.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果 由表10可知,實(shí)驗(yàn)組的乳酸脫氫酶活性高于空白組,與空白組相比,產(chǎn)品的中、高劑量組、紅參提取液組和紅景天提取液組差異顯著(P<0.05),由此表明本產(chǎn)品對(duì)小鼠的NK細(xì)胞活性有明顯的提升,此試驗(yàn)結(jié)果與謝向良等[14]的結(jié)果相同。

表10 產(chǎn)品對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響Table 10 Effect of product on the activity of mouse NK cells

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)獲得紅參最佳提取工藝:液料比32∶1 mL/g、超聲功率270 W、超聲時(shí)間32 min。紅景天最佳提取工藝為:液料比40∶1 mL/g、超聲功率300 W、超聲時(shí)間30 min;產(chǎn)品最優(yōu)配方為:紅參提取液2%,紅景天提取液1.5%,大棗汁3%,白砂糖6%。給樣組小鼠的臟器指數(shù)、細(xì)胞免疫功能、NK細(xì)胞活性均高于空白對(duì)照組,其中綜合試驗(yàn)結(jié)果,中劑量組的細(xì)胞免疫功能-耳腫脹程度(47.30%±3.38%)比空白組(9.90%±3.41%)提高了37.40%左右,NK細(xì)胞活性((766.253±94.021) U/L)比空白組((261.690±69.281) U/L)提高192.81%左右,提高效果較為明顯,說(shuō)明并不是本產(chǎn)品的劑量越大越好。人參皂苷和紅景天苷的濃度過(guò)高時(shí)反而不會(huì)對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的活性起到促進(jìn)作用,因此應(yīng)該選擇合適的劑量。本項(xiàng)目開發(fā)的紅參-紅景天功能飲品產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特,口感醇厚,有提高免疫力的功效,可作為食品或保健食品用于亞健康人群調(diào)節(jié)免疫力,具有廣闊的市場(chǎng)前景。