,*

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361021;2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建廈門 361021)

西蘭花(Brassicaoleracea)又名青花菜,為十字花科蕓薹屬植物,營(yíng)養(yǎng)豐富,具有很高的食用價(jià)值[1]。我國(guó)西蘭花產(chǎn)量居世界前列,目前已實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)周年生產(chǎn),各地的生產(chǎn)季節(jié)相互交叉[2],但除可食用的花球部分,產(chǎn)生大量西蘭花莖葉等副產(chǎn)物,除少部分作為飼料外,大部分在田里腐敗,引起空氣污染及水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問(wèn)題[3]。

研究表明,西蘭花富含蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,以及膳食纖維、類黃酮和蘿卜硫素等功能成分,具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、增強(qiáng)免疫力[6]等活性,經(jīng)常食用可降低某些癌癥、心血管疾病和糖尿病的發(fā)病率[7-9]。目前,關(guān)于西蘭花營(yíng)養(yǎng)成分的研究較多,Thejass等[10]報(bào)道了西蘭花中蘿卜硫素增強(qiáng)小鼠免疫活性,Reis等[11]分析了西蘭花中類胡蘿卜素、類黃酮、多酚等化合物的抗氧化活性,Mandimika等[12]的研究表明西蘭花膳食纖維能夠降低大鼠血脂。在西蘭花莖葉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分中,蛋白含量占干物質(zhì)20%以上[13],是極好的植物蛋白資源,有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。

我國(guó)城市居民疾病死亡率最高的是心腦血管疾病[14],高血脂是心腦血管疾病的主要影響因素。膳食中的功能活性物質(zhì)對(duì)高血脂疾病有良好的預(yù)防作用,尤其是植物蛋白源類物質(zhì)[15],文獻(xiàn)相繼報(bào)道大豆[16-17]、大米[18]、大蒜[19]等植物蛋白具有降血脂的功能。本文用胰蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白,通過(guò)膜分離和冷凍干燥,得到西蘭花莖葉蛋白肽,并對(duì)其降小鼠血脂活性進(jìn)行研究,以期為西蘭花莖葉蛋白開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花莖葉蛋白漿 浙江臺(tái)州天萊生物科技有限公司,西蘭花莖葉蛋白漿經(jīng)真空冷凍干燥后,儲(chǔ)存在干燥的環(huán)境中待用(干物質(zhì)蛋白含量46.34%);胰蛋白酶(酶活為75623 U/g 源葉生物科技有限公司;細(xì)胞色素C、胰島素、桿菌肽、氧化型谷胱甘肽、Gly-Gly-Gly(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;小鼠普通飼料 北京華阜康公司;小鼠高脂飼料 自行配制[20-21](豬油15%、蔗糖20%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、基礎(chǔ)飼料63.6%);甘油三酯(TC)檢測(cè)試劑盒、總膽固醇(TG)檢測(cè)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)試盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級(jí)KM種雄性小鼠 許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004 北京華阜康公司。

JDC-0.2真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;CeraMem0100陶瓷膜小型設(shè)備、RNF0460多功能卷式膜小型設(shè)備 廈門福美科技有限公司;ULTMATE3000高效液相色譜儀 美國(guó)賽默飛公司;3K30冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;邁瑞B(yǎng)S-240vet全自動(dòng)生化分析儀 邁瑞醫(yī)療國(guó)際有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西蘭花莖葉蛋白酶解條件的優(yōu)化

1.2.1.1 西蘭花莖葉蛋白酶解工藝流程 西蘭花莖葉蛋白漿凍干粉末→加入適量的水→調(diào)節(jié)溶液pH至酶最適pH→加入適量的蛋白酶→在酶最適溫度下進(jìn)行酶解→95 ℃滅酶20 min→制備西蘭花蛋白肽

1.2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定胰蛋白酶酶解時(shí)間為3 h,以水解度為響應(yīng)值,分析pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度(固形物濃度)對(duì)胰蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白效果的影響建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)。其響應(yīng)面因素水平表如表1所示:

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and level tables of response surface analysis

1.2.1.3 蛋白水解度的測(cè)定 用甲醛滴定法[22]測(cè)定水解液的氨基氮含量,凱氏定氮法[23]測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量,通過(guò)式(1)計(jì)算水解度。

水解度DH(%)=C×(V1-V0)×0.014×m/(5×M)×100

式(1)

式中:C:NaOH濃度(mol/L),V1:樣品在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL),V0:空白在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL),m:酶解液氨基氮質(zhì)量(mg),M:樣品總氮質(zhì)量(mg)。

1.2.2 HPLC測(cè)定西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物蛋白肽分子量分布 參考國(guó)標(biāo)GB/T 22729-2008。采用TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)凝膠色譜柱。流動(dòng)相:乙腈∶超純水∶TFA=45∶55∶0.1 (V∶V),流速:0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm,柱溫:30 ℃。

校正曲線用的標(biāo)準(zhǔn)品:細(xì)胞色素C(MW12384 Da)、胰島素(MW 5777.54 Da)、桿菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)。

1.2.3 西蘭花莖葉蛋白肽酶解產(chǎn)物的制備 西蘭花莖葉蛋白漿→胰蛋白酶水解(優(yōu)化后的條件)→200 nm孔徑陶瓷濾膜(進(jìn)膜壓力3 bar,循環(huán)流量80 LPM,25 ℃),取透過(guò)液→200 Da孔徑卷式膜(進(jìn)膜壓力25 bar,循環(huán)流量25 LPM,25 ℃),取截留液→冷凍干燥→西蘭花莖葉蛋白肽

1.2.4 小鼠降血脂活性的研究

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 參考禇斌杰[24]方法稍作修改。KM種雄性小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,將小鼠分為10只∕組,共6組,分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(辛伐他汀)、模型對(duì)照組和西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組,空白組小鼠喂基礎(chǔ)飼料,其他組小鼠喂高脂飼料。每日定時(shí)灌胃體積為10 mL/(kg·BW),低、中、高灌胃劑量分別為300、600、1200 mg/(kg·d),陽(yáng)性對(duì)照劑量為8 mg/(kg·d),另外兩組灌胃等體積雙蒸水。連續(xù)灌胃4周,期間每周稱量小鼠體重并按實(shí)際體重調(diào)整灌胃體積。末次灌胃后,禁食過(guò)夜,次日取血。

1.2.4.2 血脂水平測(cè)定 測(cè)定項(xiàng)目:血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定按照南京建成生物工程研究所的相應(yīng)測(cè)試盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4.3 AI指數(shù)的計(jì)算 動(dòng)脈硬化指數(shù)(arteriosclerosis index,AI)根據(jù)式(2)計(jì)算[25]:

動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)=(TC-HDL-C)/HDL-C

式(2)

式中:TC:根據(jù)測(cè)試盒用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)出的總膽固醇含量(mmol/L);HDL-C:根據(jù)測(cè)試盒用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)出的高密度脂蛋白膽固醇含量(mmol/L)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 西蘭花莖葉蛋白胰蛋白酶水解條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以水解度為響應(yīng)值,選擇pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度,建立四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

運(yùn)用Design-Expert.8.0.6.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合分析,得到胰蛋白酶對(duì)pH(A)、溫度(B)、底物濃度(C)和加酶量(D)的二次多元回歸方程:Y=19.34+0.62A+1.22B+4.39C+0.69D+0.050AB-1.96AC+1.25AD-1.06BC+0.14BD+0.035CD-1.16A2-0.81B2-0.72C2-0.42D2,R2=0.9885。根據(jù)實(shí)驗(yàn)軟件所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,模型具有較高的F值和較低的P值(P<0.01),說(shuō)明該模型具有較高的相關(guān)性,且失擬項(xiàng)為0.0789,不顯著,表明所建立的回歸模型能夠應(yīng)用于理論預(yù)測(cè)[26]?；貧w方程的各項(xiàng)方差分析表明,A、B、C、D、AC、AD、BC、A2、B2、C2對(duì)水解度有極顯著的影響(P<0.01),各因素對(duì)胰蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白的影響主次順序?yàn)?底物濃度(C)>溫度(B)>加酶量(D)>pH(A)。

圖1采用Design-Expert 8.06軟件作圖,當(dāng)pH、溫度、底物濃度、加酶量任意兩個(gè)因素取零水平時(shí),剩余的兩個(gè)因素對(duì)水解度的影響，由響應(yīng)面陡峭程度及等高線可知，pH與底物濃度(AC)、pH與加酶量(AD)、溫度與底物濃度(BC)的交互作用影響顯著。由圖(a)可知,當(dāng)pH不變時(shí),隨著底物濃度的升高,水解度逐漸升高,上升趨勢(shì)較明顯;而底物濃度不變時(shí),隨著pH的升高,水解度先升高后下降,趨勢(shì)較緩慢,說(shuō)明與pH相比,底物濃度為主要影響因素。由圖(b)可知,當(dāng)加酶量不變時(shí),隨著pH的增大,水解度表現(xiàn)出先緩慢上升后逐漸下降的趨勢(shì),趨勢(shì)較陡;當(dāng)pH不變時(shí),隨著加酶量的增加,水解度逐漸上升,上升趨勢(shì)較明顯,表明與pH相比,加酶量為主要影響因素。由圖(c)可知,當(dāng)溫度一定時(shí),水解度隨著底物濃度的增加逐漸增大,有較明顯的趨勢(shì);當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),隨著溫度的升高,水解逐漸增大,但趨勢(shì)較緩慢,因此相對(duì)于溫度,底物濃度為主要影響因素。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

圖1 因素間相互作用的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface diagram of the interaction between factors

經(jīng)過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析優(yōu)化后得到胰蛋白酶對(duì)西蘭花莖葉蛋白酶解的最優(yōu)條件為pH7.5、酶解溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物濃度4.0%,此條件下胰蛋白酶實(shí)際水解度為22.37%±0.46%,與理論水解度23.40%基本一致。

2.2 西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞色素C(MW12384 Da)、胰島素(MW5777.54 Da)、桿菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫時(shí)間和相對(duì)分子質(zhì)量來(lái)測(cè)定酶解產(chǎn)物的分子量分布。其中細(xì)胞色素C的洗脫時(shí)間為11.90 min,胰島素為14.13 min,桿菌肽為15.86 min,氧化型谷胱甘肽為19.01 min,Gly-Gly-Gly為19.85 min。西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布如圖2所示,以標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積為橫坐標(biāo),相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖,如圖3所示。Log(MW)與X(洗脫體積)成線性關(guān)系,對(duì)應(yīng)的線性關(guān)系方程為L(zhǎng)og(MW)=-0.4313X+6.6974,決定系數(shù)R2=0.9602,根據(jù)線性關(guān)系方程,發(fā)現(xiàn)西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物分子量主要集中在1000～3000 Da,占總數(shù)的64.35%。

圖2 西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of proteolytic products of broccoli stems and leaves

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子量對(duì)數(shù)與其洗脫體積之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between the relative molecular weight of the standard and its elution volume

2.3 西蘭花莖葉蛋白肽的降血脂活性

高脂血癥可引起動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗塞和腦卒中等多種嚴(yán)重危害人體健康的疾病[27]。有研究報(bào)道了膳食蛋白在調(diào)節(jié)膽固醇代謝中有重要作用[28-30],尤其是大豆蛋白[31]、大米蛋白[32]等植物性蛋白作用明顯,而大豆蛋白的酶解物表現(xiàn)出比未消化的蛋白質(zhì)具有更高的降膽固醇活性[33],蛋白酶解產(chǎn)物可降低TC、TG、LDL-C含量和增加HDL-C含量[34-36]。

由圖4～圖7可知,本研究發(fā)現(xiàn),西蘭花莖葉蛋白肽的劑量與降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量之間呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系,在300 mg/(kg·d)的灌胃劑量下,西蘭花莖葉蛋白肽表現(xiàn)出一定的降血脂活性,在600、1200 mg/(kg·d)的灌胃條件下,TC、TG、LDL-C 含量與模型組有極顯著差異(P<0.01),強(qiáng)于黑豆肽1000 mg/(kg·d)的有效灌胃劑量[37]。于TC、TG、LDL-C、HDL-C含量方面,模型組與空白組之間有極顯著差異(P<0.01),與模型組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組TC含量均有極顯著差異(P<0.01),TC含量極顯著降低(P<0.01);陽(yáng)性對(duì)照組和中、高劑量組TG和LDL-C含量之間也有極顯著差異(P<0.01),低劑量組TG和LDL-C含量與模型組存在顯著差異(P<0.05),它們的TG和LDL-C含量均明顯降低。由圖7可知,陽(yáng)性對(duì)照和低、中劑量組與模型組相比在HDL-C含量上有極顯著差異(P<0.01),但高劑量組與模型組差異不顯著(P>0.05),可能是因?yàn)楦邼舛葮悠肥剐∈螽a(chǎn)生抗藥性[38]。

圖4 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠TC含量的影響Fig.4 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TC content in mice注:與空白組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖5～圖10同。

圖5 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠TG含量的影響Fig.5 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TG content in mice

圖6 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠LDL-C含量的影響Fig.6 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on LDL-C content in mice

圖7 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠HDL-C含量的影響Fig.7 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on HDL-C content in mice

動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)是一個(gè)衡量動(dòng)脈硬化程度的指標(biāo),AI越小，表明患動(dòng)脈粥樣硬化的可能性越小,它在預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)生、發(fā)展和嚴(yán)重程度方面更優(yōu)于non-HDL-C和LDL-C[39]。由圖8可知,模型組與空白組有極顯著差異(P<0.01),模型組AI指數(shù)明顯上升。陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組與模型組相比均有極顯著差異(P<0.01),從低劑量到高劑量的AI指數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),表明灌胃劑量為600 mg/(kg·d)最利于小鼠AI指數(shù)的降低，其AI指數(shù)最為接近陽(yáng)性對(duì)照組,但還是明顯高于空白組,表明在中劑量時(shí)能有效降低AI,但不能恢復(fù)至正常水平,這與李漢臣等[40]的研究結(jié)果一致。

圖8 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠AI指數(shù)的影響Fig.8 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AI index in mice

AST和ALT主要存在于肝臟的肝細(xì)胞內(nèi),當(dāng)肝臟受損時(shí),轉(zhuǎn)氨酶會(huì)釋放到血液中去,所以血液檢測(cè)中轉(zhuǎn)氨酶值會(huì)偏高[41]。ALT和AST是用來(lái)衡量肝臟功能的指標(biāo)。由圖9和圖10可知,模型組與空白組之間有極顯著差異(P<0.01),模型組的ALT和AST含量明顯升高。陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組與模型對(duì)照組相比在ALT含量上均有極顯著差異(P<0.01),高劑量組降低ALT含量效果最為明顯。在AST含量方面,低劑量組與模型組之間無(wú)顯著差異;中、高劑量組與模型組之間有極顯著差異(P<0.01),明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組,表明西蘭花莖葉蛋白肽在較高濃度下具有較好的降低AST含量的效果。高血脂易引起脂肪肝,脂肪肝常表現(xiàn)出AST異常,AST明顯增加意味著可能有嚴(yán)重的肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)損害[42]。西蘭花莖葉蛋白肽在低劑量時(shí),小鼠體內(nèi)AST含量與模型組之間無(wú)顯著差異,在高劑量時(shí)血液中 AST和ALT含量降低明顯,基本和空白組一致,表明西蘭花莖葉蛋白肽能夠在一定程度上降低由高血脂引起的肝細(xì)胞損傷。

圖9 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠ALT的影響Fig.9 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on ALT in mice

圖10 西蘭花莖葉蛋白肽對(duì)小鼠AST的影響Fig.10 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AST in mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以水解度為指標(biāo),在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò) Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)和回歸分析,得出胰蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的最佳工藝參數(shù)為:pH7.5、酶解溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物濃度4.0%,此條件下胰蛋白酶平均水解度為22.37%±0.46%。對(duì)西蘭花莖葉蛋白肽的降血脂活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),西蘭花莖葉蛋白肽的低、中、高劑量組均有助于改善高血脂癥小鼠的血脂水平,且呈現(xiàn)劑量性依賴,并有助于降低高脂膳食小鼠的AI指數(shù)和血液 AST和ALT含量,表現(xiàn)出預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和脂肪肝活性,為西蘭花莖葉蛋白肽降血脂功能食品開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。