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(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇連云港 222005;2.江蘇耕耘化學(xué)有限公司,江蘇連云港 222005)

白色念珠菌(Candidaalbicans)又稱白假絲酵母菌,是一種寄生在人體皮膚、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)等的條件致病性真菌[1],是導(dǎo)致真菌感染的重要致病菌之一,也是重要的食源性致病菌[2]。近年來(lái),白色念珠菌感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),臨床上有效的抗白色念珠菌的藥物非常有限。由于白色念珠菌的自身特性,容易在一些生物材料表面形成生物被膜,且生物被膜對(duì)大多數(shù)現(xiàn)有的抗真菌藥物都表現(xiàn)出高度耐藥性特點(diǎn),給臨床治療帶來(lái)較大困難[3]。因此,尋找新型抗白色念珠菌以及能夠有效抗生物被膜的藥物顯得意義重大。

海洋作為一個(gè)復(fù)雜、開(kāi)放、變化的生物有機(jī)系統(tǒng),造就了生物類群的多樣性[4]。海洋中的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌及病毒等,提供地球近一半的初級(jí)生產(chǎn)力,能夠影響氣候變化[5],參與物質(zhì)和能量循環(huán)[6]。海洋微生物及其代謝產(chǎn)物種類豐富,結(jié)構(gòu)特異,已成為21世紀(jì)新型藥物研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[7-8]。其中,海洋細(xì)菌分布廣、種類多,產(chǎn)生的活性物質(zhì)多種多樣、分子結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特,被廣泛用于新藥物的開(kāi)發(fā)[9-10]。

芽孢桿菌(Bacillus)是自然界中種類多、分布廣的優(yōu)勢(shì)微生物菌群,大多為非致病性、對(duì)人畜無(wú)害[11],很多種類具有較強(qiáng)的抑菌作用,能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),具有繁殖能力強(qiáng)、耐熱、耐酸堿等優(yōu)點(diǎn)[12],許多學(xué)者從不同環(huán)境中分離篩選到多種具有不同抗菌作用的芽孢桿菌,廣泛用于動(dòng)植物病害的生物防治。不同種類和來(lái)源的芽孢桿菌可以產(chǎn)生不同的抗菌物質(zhì),具有不同的抗菌作用機(jī)理。已有的研究表明,芽孢桿菌可以產(chǎn)生脂肽類、肽類、磷脂類、細(xì)菌素等多種抗菌物質(zhì),有的還能產(chǎn)生揮發(fā)性的抑菌物質(zhì),具有抑制真菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的作用[13]。其中脂肽類物質(zhì)是多數(shù)芽孢桿菌產(chǎn)生的重要的具有抑菌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是很多芽孢桿菌發(fā)揮抑菌作用的主要機(jī)制。脂肽類物質(zhì)由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成[14-15],通過(guò)疏水脂肪烴鏈和氨基酸作用于靶細(xì)胞的細(xì)胞膜,擾亂膜結(jié)構(gòu),使細(xì)胞膜受到損傷,最終抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或死亡[16]。也有學(xué)者認(rèn)為,脂肽類抗菌物質(zhì)吸附于細(xì)胞膜上,但不直接作用于細(xì)胞膜本身,而是穿過(guò)細(xì)胞膜,作用于細(xì)胞內(nèi)的生物大分子,例如蛋白質(zhì)和DNA分子等,最終導(dǎo)致敏感菌株死亡[17]。由于脂肽類物質(zhì)的抑菌功能,還可以適量添加到食品中提高食品的新鮮程度,延長(zhǎng)食品保質(zhì)期,節(jié)約能源和糧食。

近年來(lái),本課題組在對(duì)黃海海域的抗菌海洋微生物資源篩選研究中,分離得到了多個(gè)具有抗菌活性的海洋微生物優(yōu)良菌株。發(fā)現(xiàn)一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1菌株及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌(Canidiaalbicans)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternariasolania)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、蘋果腐爛病菌(Valsamal)、斑點(diǎn)落葉病菌(Alternariaalternate)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cucumarimum)等多種病原菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[18-19],且抗菌作用對(duì)紫外線、溫度、光照、酸堿度和蛋白酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[20],但有關(guān)該菌株對(duì)白色念珠菌的抑菌作用機(jī)理尚未見(jiàn)報(bào)道,本文采用掃描電鏡法、MTT法、分光光度法初步探究海洋細(xì)菌GM-1-1菌株對(duì)白色念珠菌的抗菌作用機(jī)理,為該菌株的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1 本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域中分離獲得并保藏;白色念珠菌(Candidaalbicans) 南京便診生物科技有限公司;RPMI1640液體培養(yǎng)基 AR,HyClone公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT) AR,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、吐溫80、二甲基亞砜、十二水合磷酸氫二鈉 AR,南京化學(xué)試劑股份有限公司;鹽酸、玉米糊精、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀 AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏 BR,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

JSM-6390LA掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;Ultrospec 3300 Pro核酸蛋白定量?jī)x 通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部;Tecan Infinite F50酶標(biāo)儀 帝肯(上海)貿(mào)易有限公司;XS-212江南生物顯微鏡 南京向日葵光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 GM-1-1菌株和白色念珠菌活化培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;GM-1-1菌株種子培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、葡萄糖5 g/L,蒸餾水1000 mL;GM-1-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米糊精20 g/L,牛肉膏15 g/L,硫酸鎂1.4 g/L;白色念珠菌種子培養(yǎng)基:PD培養(yǎng)基;白色念珠菌發(fā)酵培養(yǎng)基:沙氏液體培養(yǎng)基,葡萄糖40 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1000 mL;YPD液體培養(yǎng)基(用于白色念珠菌生物被膜形成試驗(yàn)):葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸餾水1000 mL。

1.2.2 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液的制備 將斜面上培養(yǎng)24 h的GM-1-1菌株接種至裝有60 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28 ℃,180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h,調(diào)整細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL,作為種子液,按10%的接種量接入裝有50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,28 ℃,220 r/min搖床培養(yǎng)28 h。發(fā)酵液在4 ℃、9000 r/min的條件下離心20 min,棄菌體,得無(wú)菌體的發(fā)酵液,備用。

1.2.3 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液抗菌性質(zhì)的初步探究 采用牛津杯法。取培養(yǎng)24 h細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL白色念珠菌菌懸液200 μL,均勻涂布在直徑9 cm的PDA平板上,在平板中央放置1個(gè)牛津杯,加入200 μL GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液,28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,十字交叉法測(cè)定抑菌圈的直徑。在無(wú)菌操作條件下,用打孔器取抑菌圈內(nèi)的培養(yǎng)基,表面朝下接種于新鮮PDA平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,觀察平板上是否有菌落長(zhǎng)出。

1.2.4 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響 1.5 mL EP管中加入培養(yǎng)24 h細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL白色念珠菌菌懸液100 μL和等量的無(wú)菌發(fā)酵液充分混勻,再加入100 μL沙氏液體培養(yǎng)基,30 ℃下恒溫培養(yǎng),分別于1、2、3、4、5 h時(shí)取培養(yǎng)液于無(wú)菌載玻片上,觀察孢子萌發(fā)的情況,計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.5 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響 采用掃描電鏡法。取抑菌圈邊緣內(nèi)側(cè)的白色念珠菌于掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),以正常狀態(tài)培養(yǎng)下的白色念珠菌作為對(duì)照,比較處理組與對(duì)照組白色念珠菌菌體的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.6 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響

1.2.6.1 白色念珠菌生物被膜的培養(yǎng) 將白色念珠菌接種于YPD培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h,離心收集菌體,用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋,調(diào)整菌液細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入100 μL菌液,37 ℃培養(yǎng)2 h,棄去培養(yǎng)基,用pH7.4、0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次,多孔板底部形成白色生物被膜。加入100 μL RPMI1640培養(yǎng)基,作為培養(yǎng)的0點(diǎn)。

1.2.6.2 白色念珠菌生物被膜的測(cè)定 采用MTT法。棄去多孔板中最后培養(yǎng)液,用PBS緩沖液輕輕洗去懸浮細(xì)胞,每孔加入100 μL PBS緩沖液及20 μL MTT,37 ℃孵育4 h后棄上清,每孔加入100 μL二甲基亞砜,振蕩5 min,室溫靜置30 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD492值[21]。每個(gè)處理4個(gè)孔,為4次重復(fù)。

1.2.6.3 不同濃度無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響 在白色念珠菌生物被膜培養(yǎng)的0點(diǎn),分別加入0%、5%、10%、20%、40%、60%、100%不同稀釋度的GM-1-1發(fā)酵液,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,測(cè)定不同濃度GM-1-1發(fā)酵液處理的OD492值[22]。比較不同處理的OD值的大小,分析不同濃度無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響。

1.2.6.4 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響 分別在白色念珠菌生物被膜形成后的0、2、12、24、48、72 h時(shí)加入100 μL菌株GM-1-1發(fā)酵液,以等量的RPMI1640培養(yǎng)基為空白對(duì)照,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。測(cè)定不同處理的OD492值。每個(gè)時(shí)間為一個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.2.7 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞通透性的影響 將培養(yǎng)18 h的白色念珠菌菌懸液10000 r/min離心20 min收集菌體,PBS洗滌三次。用含0.001% Tween80的PBS懸浮細(xì)胞,菌體細(xì)胞濃度調(diào)至109個(gè)/mL。向懸浮細(xì)胞中加入1.5 mL GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液,以等量的無(wú)菌水為對(duì)照,37 ℃、180 r/min培養(yǎng),分別于0、1、2、4、6 h取樣,4 ℃、10000 r/min離心,測(cè)定上清液OD260值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Excel和Origin 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液抗菌性質(zhì)初步探究

從圖1可以看到,牛津杯周圍出現(xiàn)了清晰的抑菌圈,抑菌圈直徑達(dá)39.5 mm,表明GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。

圖1 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of sterile fermentation broth on Candida albicans

取透明圈中央的瓊脂塊接種到新的PDA平板上,培養(yǎng)36 h后平板上長(zhǎng)出了白色念珠菌菌落,說(shuō)明GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液處理后的白色念珠菌并未死亡,在轉(zhuǎn)移至不含無(wú)菌發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基上后可繼續(xù)繁殖形成菌落,初步認(rèn)為GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的繁殖具有抑制作用,處理后的白色念珠菌不能形成新的細(xì)胞,但不能殺死已經(jīng)形成的細(xì)胞。

2.2 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響

如圖2,用無(wú)菌發(fā)酵液處理白色念珠菌的孢子后,活的孢子能夠發(fā)育形成菌落,而死孢子仍為單個(gè)細(xì)胞。由圖3可知,對(duì)照組白色念珠菌的孢子萌發(fā)率隨時(shí)間增加迅速提高,5 h時(shí)白色念珠菌孢子的萌發(fā)率達(dá)到92.44%;而GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液處理的白色念珠菌孢子萌發(fā)率低,5 h時(shí)孢子的萌發(fā)率僅為34.22%,明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌孢子的萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用。

圖2 5 h時(shí)白色念珠菌孢子萌發(fā)情況(400×)Fig.2 Spore germination of Candida albicans at 5 h(400×)

圖3 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌孢子萌發(fā)的影響Fig.3 Effect of sterile fermentation broth on spore germination of Candida albicans

2.3 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響

在掃描電子顯微鏡下觀察無(wú)菌發(fā)酵液處理的白色念珠菌以及正常生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),無(wú)菌發(fā)酵液處理后的白色念珠菌細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯凹陷,凹陷大小不一,細(xì)胞壁殘缺,細(xì)胞上出現(xiàn)破洞,菌體出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)(圖4B);未處理的白色念珠菌菌體細(xì)胞完整光滑,形態(tài)規(guī)則、飽滿(圖4A)。說(shuō)明無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài)具有較強(qiáng)的破壞作用。該結(jié)果與劉全永等[23]通過(guò)掃描電鏡觀察分離自海水的凝結(jié)芽孢桿菌黑石礁亞種LU-B02菌株發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)影響的結(jié)果一致。

圖4 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of sterile fermentation broth on cell morphology of Candida albicans

2.4 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響

2.4.1 不同濃度無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響 由圖5可知,GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜的形成影響較為明顯,在供試發(fā)酵液的濃度范圍內(nèi),OD492值均顯著低于對(duì)照(P<0.05);且隨著發(fā)酵液濃度的增加,OD492值越低,但不同濃度處理的OD492值差異不顯著(P>0.05)。對(duì)比談潘莉等[22]采用XTT法評(píng)價(jià)黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物被膜形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果,隨著濃度的增加,黃根醇提取物對(duì)白色念珠菌生物被膜的抑制作用增強(qiáng),呈正相關(guān)關(guān)系,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相同的變化趨勢(shì)。

圖5 不同濃度的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of different concentrations of sterile fermentation broth on the biofilm formation of Candida albicans注:不同小寫(xiě)字母代表差異性顯著(P<0.05),圖6、圖7同。

2.4.2 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用,不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率不同，結(jié)果如圖6。0和2 h無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜的抑制作用較強(qiáng),抑制率分別為89.01%和86.06%,二者差異不顯著(P>0.05);2 h后抑制率明顯下降,不同時(shí)間的抑制率均顯著低于0和2 h(P<0.05)。Chandra等[24]將白色念珠菌生物被膜的形成分為3個(gè)階段:早期(0～11 h),中期(12～30 h)和成熟期(38～72 h)。早期的黏附尤為重要,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),生物被膜逐漸發(fā)育成熟,抑制黏附是抗白色念珠菌生物被膜感染的關(guān)鍵措施[22]。

圖6 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌生物被膜形成不同階段的影響Fig.6 Effect of sterile fermentation broth on different stages of Candida albicans biofilm formation

2.5 GM-1-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞通透性的影響

如圖7所示,在1～6 h范圍內(nèi),處理組的OD260值均高于對(duì)照組,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng),對(duì)照組與處理組OD值的差異越來(lái)越大,達(dá)到顯著水平(P<0.05)。培養(yǎng)時(shí)間為6 h時(shí),對(duì)照組的OD260值為0.506,而處理組的OD260值為0.697,明顯高于對(duì)照組,表明無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的細(xì)胞通透具有一定的影響。孟松[25]將從藠頭中分離出的活性物質(zhì)作用于白色念珠菌,細(xì)胞通透性試驗(yàn)結(jié)果表明，藠頭活性物質(zhì)導(dǎo)致白色念珠菌OD260特征吸收值物質(zhì)的泄露,破壞了細(xì)胞的通透性,導(dǎo)致細(xì)胞活力下降甚至死亡。

圖7 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌細(xì)胞通透性的影響Fig.7 Effect of sterile fermentation broth on the permeability of Candida albicans cells

3 結(jié)論

本文以白色念珠菌為指示菌,初步探討了GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)白色念珠菌的抗菌性質(zhì)及其抗菌作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液能明顯抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)和繁殖，抑菌圈直徑達(dá)39.5 mm,對(duì)孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用，GM-1-1菌株無(wú)菌發(fā)酵液處理5 h時(shí)孢子萌發(fā)率僅為34.22%;能夠破壞白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài);抑制白色念珠菌生物被膜的形成；破壞了細(xì)胞的通透性。本試驗(yàn)結(jié)果為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。