李媛媛,王永紅

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

乳酸是一種多用途的有機(jī)酸,在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)和制藥等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用[1],特別是近年來(lái)乳酸作為可降解生物基塑料制品聚乳酸材料的單體,其生產(chǎn)研究持續(xù)受到廣泛關(guān)注[2]。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[3],其可在高溫、低pH、不滅菌條件下發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸[4-5],這些特性極大降低了乳酸的生產(chǎn)成本,也讓其成為了乳酸工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)菌種。

工業(yè)上生產(chǎn)乳酸通常采用淀粉質(zhì)水解物作為碳源,但在乳酸生產(chǎn)停止時(shí)發(fā)酵液中會(huì)留有較高濃度的殘?zhí)?這不僅會(huì)降低糖酸轉(zhuǎn)化率,也致使后續(xù)乳酸分離純化的難度增加[6]。因此,篩選抗分解代謝物阻遏的菌株對(duì)降低殘?zhí)菨舛群秃罄m(xù)降解殘?zhí)嵌际直匾?。在前期的研究?本實(shí)驗(yàn)室以B.coagulansHL5-C為出發(fā)菌株,通過(guò)常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)并結(jié)合抗葡萄糖分解代謝物阻遏篩選模型獲得了一株抗碳源分解代謝物阻遏能力的菌株B.coagulans5E-1[7]。此突變株5E-1除表現(xiàn)出耐高溫、耐酸、高產(chǎn)、產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸等良好生物學(xué)特性外,還可以在利用葡萄糖的同時(shí)快速利用其他糖類,大大縮短了乳酸發(fā)酵過(guò)程殘?zhí)堑慕到鈺r(shí)間和整個(gè)發(fā)酵周期,提高發(fā)酵效率。

為了更好地闡釋突變株和原始菌株在生理代謝上的差異,本研究通過(guò)出發(fā)菌株和突變株發(fā)酵特性的對(duì)比,從其合成培養(yǎng)基的優(yōu)化、單一碳源及混合碳源的利用情況等方面考察了兩菌株之間的差異,為研究凝結(jié)芽孢桿菌碳源分解代謝物阻遏效應(yīng)的機(jī)制及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

B.coagulansHL5-C(由B.coagulansHL5通過(guò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法選育得到)、B.coagulans5E-1(由B.coagulansHL5-C通過(guò)常壓室溫等離子誘變方法并結(jié)合抗葡萄糖代謝物阻遏篩選模型獲得) 均由本實(shí)驗(yàn)室保藏;無(wú)水葡萄糖、碳酸鈣 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;L-氨基酸(20種) 上海阿拉丁生化科技有限公司;蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 英國(guó)OXOID;麥芽糖、木糖、果糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、半乳糖 上海生工生物工程股份有限公司;低聚異麥芽糖 南京都萊生物技術(shù)公司。

離子色譜HPAEC-PAD 美國(guó)Thermo公司;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海華連醫(yī)療器械有限公司;ZWY-211C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)柜 上海智城分析儀器制造有限公司;752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 茄子瓶斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母膏10,牛肉膏10,無(wú)水乙酸鈉4,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫二鉀2,100倍母液(MgSO40.2,MnSO40.2,NaCl 0.03,FeSO40.01)10,吐溫80(mL)1,瓊脂18,無(wú)水葡萄糖40,CaCO310,NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。

MRS種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母膏10,牛肉膏10,無(wú)水乙酸鈉4,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫二鉀2,100倍母液(MgSO40.2,MnSO40.2,NaCl 0.03,FeSO40.01)10,吐溫80(mL)1,無(wú)水葡萄糖40,CaCO310,NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。

全物質(zhì)合成培養(yǎng)基[7](g/L):無(wú)水葡萄糖40;20種氨基酸0.5;腺嘌呤0.075,鳥嘌呤0.075,胸腺嘧啶0.075,胞嘧啶0.075,尿嘧啶0.075;生物素0.005,泛酸鈣0.005,氯化膽堿0.005,肌醇0.005,葉酸0.005,煙酸0.005,對(duì)氨甲苯甲酸0.005,維生素B10.005,維生素B20.005,維生素B60.005,維生素B120.005;乙酸鈉2,檸檬酸氫二銨1,K2HPO43,KH2PO43,(NH4)2SO43,CaCl20.1,MgSO40.5,MnSO40.05,FeSO40.02,CoSO40.01,CuSO40.01,NiSO40.01,ZnSO40.01,(NH4)6Mo7O240.01,NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。

合成培養(yǎng)基MCDM3++[8](g/L):無(wú)水葡萄糖40;丙氨酸0.5,精氨酸0.5,半胱氨酸0.5,谷氨酸0.5,組氨酸0.5,亮氨酸0.5,異亮氨酸0.5,甲硫氨酸0.5,蘇氨酸0.5,酪氨酸0.5,纈氨酸0.5;葉酸0.005,維生素B10.005;鳥嘌呤0.075;乙酸鈉2,檸檬酸氫二銨1,K2HPO43,KH2PO43,MgSO40.5,MnSO40.05,FeSO40.02,NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。

1.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌的種子制備和發(fā)酵培養(yǎng) 利用本實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏的凝結(jié)芽孢桿菌甘油管,取其內(nèi)菌液250 μL均勻涂布于茄子瓶斜面培養(yǎng)基上,在55 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行第一次活化,24 h后轉(zhuǎn)接至新斜面,培養(yǎng)14 h,完成二次活化,用50 mL滅菌水將活化菌株從茄子瓶斜面培養(yǎng)中洗脫下來(lái)后接入(按15%接種量(V/V))種子搖瓶培養(yǎng)基中,55 ℃ 100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,種子制備過(guò)程完成。

發(fā)酵培養(yǎng):種子液4000 r/min離心7 min,去上清并用無(wú)菌水重懸,相同條件下二次離心、去上清,并用與原種子液等體積的無(wú)菌水重懸、振蕩均勻,上述菌液按10%(V/V)的接種量接入發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基,搖床(55 ℃,100 r/min)振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)方法 菌體光密度:紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定;葡萄糖、乳酸含量:使用SBA-40E生物傳感分析儀測(cè)定(定量前需將樣品稀釋至量程范圍內(nèi),葡萄糖測(cè)定范圍為0～1 g/L,乳酸測(cè)定范圍為0～0.5 g/L);海藻糖、半乳糖、甘露糖、果糖、異麥芽糖和麥芽糖的測(cè)定[9]:利用戴安IC-3000離子色譜系統(tǒng)檢測(cè),搭配Dionex Carbopac PA 200分離柱(3 mm×250 mm)和Dionex Carbopac PA 200保護(hù)柱(3 mm×50 mm),淋洗液體系由18 MΩ超純水、200 mmol/L NaOH溶液和1 mol/L CH3COONa溶液三部分組成,檢測(cè)系統(tǒng)需要實(shí)時(shí)接入氮?dú)?防止空氣組分(主要是CO2)與淋洗液接觸、反應(yīng)。

1.2.4 合成培養(yǎng)基的篩選方法

1.2.4.1 出發(fā)菌HL5-C合成培養(yǎng)基關(guān)鍵組分的確定 大類物質(zhì)補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn):基礎(chǔ)培養(yǎng)基MCDM3++主要包括氨基酸、維生素、堿基三大類,其中含有11種氨基酸、2種維生素、1種堿基(詳見(jiàn)1.2.1)。在MCDM3++基礎(chǔ)上,參照全物質(zhì)合成培養(yǎng)基組分進(jìn)行上述三類物質(zhì)的補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn),初步確立HL5-C的生長(zhǎng)和代謝營(yíng)養(yǎng)需求。例如,全物質(zhì)合成培養(yǎng)基含有20種氨基酸,若培養(yǎng)基添加組分為氨基酸,則指的是在MCDM3++的11種氨基酸基礎(chǔ)上外源添加余下的9種氨基酸。大類物質(zhì)補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn)在搖瓶中進(jìn)行,55 ℃ 100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,測(cè)定菌體HL5-C的光密度(OD620)。

單一堿基添加實(shí)驗(yàn):在合成培養(yǎng)基MCDM3++的基礎(chǔ)上,分別外源添加胞嘧啶C、尿嘧啶U、胸腺嘧啶T、腺嘌呤A中的一種作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基,對(duì)照組培養(yǎng)基中4種堿基(C、U、T、A)均添加,55 ℃ 100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,測(cè)定菌體HL5-C的光密度(OD620),并將篩選出的合成培養(yǎng)基命名為MCDM4。

表1 培養(yǎng)基組分設(shè)計(jì)及HL5-C生長(zhǎng)結(jié)果Table 1 Medium component design and HL5-C growth results

1.2.4.2 突變株5E-1合成培養(yǎng)基的確定 大類物質(zhì)補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn):同1.2.4.1,在MCDM4基礎(chǔ)上,參照全物質(zhì)合成培養(yǎng)基組分分別進(jìn)行氨基酸、維生素和堿基的補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn),確定影響5E-1生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵物質(zhì)是氨基酸、維生素、堿基中的一類或幾類。

單氨基酸添加實(shí)驗(yàn):參照全物質(zhì)合成培養(yǎng)基中的20種氨基酸,在MCDM4的基礎(chǔ)上進(jìn)行余下9種氨基酸(谷氨酰胺、甘氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸)的單一添加實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基中每次添加一種氨基酸,若菌體光密度(OD620)提高,則將該種氨基酸加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,再一一進(jìn)行余下氨基酸的添加;若OD620無(wú)明顯變化,則將該氨基酸剔除,最終獲得對(duì)菌株生長(zhǎng)影響明顯的氨基酸種類,并將篩選出的合成培養(yǎng)基命名為MCDM5。

1.2.4.3 合成培養(yǎng)基的驗(yàn)證 突變株5E-1種子液分別接入合成培養(yǎng)基MCDM5和全物質(zhì)合成培養(yǎng)基中,5 L發(fā)酵罐(55 ℃ 100 r/min,通氣量7.2 L/h)培養(yǎng)19 h,測(cè)定5E-1在兩種培養(yǎng)基中的OD620和乳酸產(chǎn)量。

1.2.5 出發(fā)菌株與突變株利用單一碳源的乳酸發(fā)酵 在1.2.4.2優(yōu)化的合成培養(yǎng)基MCDM5上,分別考察原始菌株HL5-C和突變株5E-1利用不同碳源作為底物的情況。其中對(duì)照組以40 g/L葡萄糖作為單一碳源,實(shí)驗(yàn)組則分別以40 g/L麥芽糖、低聚異麥芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖和蔗糖作為單一碳源。55 ℃ 100 r/min,培養(yǎng)12 h,如果實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度(OD620)高于對(duì)照組的1/3,則認(rèn)為此菌株能夠有效利用該碳源。

1.2.6 出發(fā)菌株與突變株利用混合碳源的乳酸發(fā)酵 出發(fā)菌株、突變株利用的混合碳源分別由可被HL5-C、5E-1代謝的非葡萄糖碳源(即1.2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果)和葡萄糖組成,非葡萄糖碳源濃度為20 g/L,葡萄糖濃度為40 g/L。將HL5-C和5E-1在各種混合碳源中進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)基中葡萄糖尚未耗竭的前提下,測(cè)定兩菌株對(duì)非葡萄糖碳源的利用及乳酸生產(chǎn)情況。

1.2.7 抗葡萄糖分解代謝物阻遏效應(yīng)的驗(yàn)證 混合碳源(30 g/L葡萄糖和12 g/L異麥芽糖)作為底物分別加入到HL5-C和5E-1的合成培養(yǎng)基中,5 L發(fā)酵罐(55 ℃ 100 r/min,通氣量7.2 L/h)培養(yǎng)21 h,分別測(cè)定OD620、葡萄糖消耗量、異麥芽糖消耗量和乳酸產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成培養(yǎng)基的篩選

合成培養(yǎng)基(Chemically defined medium,CDM)的成分明確且可以定量檢測(cè)[10-11],根據(jù)合成培養(yǎng)基上的發(fā)酵過(guò)程,能夠明確發(fā)酵底物的代謝流向,從而解析不同的代謝表型差異。本課題在前期研究中利用單因素缺失及模型驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)B.coagulans36D1的合成培養(yǎng)基(MCDM3++)進(jìn)行了優(yōu)化[8],但是此合成培養(yǎng)基卻無(wú)法滿足出發(fā)菌株HL5-C和突變株5E-1的生長(zhǎng)。因此,本研究在MCDM3++基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化,從而保證HL5-C和5E-1的正常生長(zhǎng)和代謝。

2.1.1 出發(fā)菌株HL5-C合成培養(yǎng)基關(guān)鍵組分的確定 參照全物質(zhì)合成培養(yǎng)基組分進(jìn)行氨基酸、維生素和堿基三類物質(zhì)的補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)基設(shè)計(jì)和結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,僅添加堿基類物質(zhì)即可大幅提高最終的細(xì)胞密度(OD620),因此后續(xù)將進(jìn)一步研究單一堿基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

單一堿基添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,C、U、T、A的添加均可以讓HL5-C正常生長(zhǎng),其中尿嘧啶U的促進(jìn)效果最為明顯,此時(shí)獲得最大的細(xì)胞密度(OD620)和乳酸積累量。綜上所述,HL5-C的生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)合成培養(yǎng)基(MCDM4)為:MCDM3++外加0.075 g/L尿嘧啶(U)。

2.1.2 突變株5E-1合成培養(yǎng)基的確定 雖然MCDM4適合于出發(fā)菌株HL5-C生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn),但是突變菌5E-1卻無(wú)法在此培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)和代謝。突變株5E-1合成培養(yǎng)基的優(yōu)化方法如1.2.4.2所述。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氨基酸是影響5E-1生長(zhǎng)和代謝的最重要因素,繼而在MCDM3++已有的11種氨基酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行單氨基酸添加實(shí)驗(yàn),確定苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸為5E-1生長(zhǎng)和代謝所必需的氨基酸,且三種氨基酸必須同時(shí)加入才能使5E-1正常生長(zhǎng)和代謝(圖1)。綜上,5E-1的生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)合成培養(yǎng)基(MCDM5)為:MCDM4,外加0.5 g/L脯氨酸、0.5 g/L賴氨酸和0.5 g/L苯丙氨酸。

表2 培養(yǎng)基組分設(shè)計(jì)及HL5-C發(fā)酵結(jié)果Table 2 Medium component design and HL5-C fermentation results

圖1 3種氨基酸對(duì)5E-1生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of 3 amino acids on 5E-1 growth

凝結(jié)芽孢桿菌是產(chǎn)乳酸細(xì)菌的一種,產(chǎn)乳酸細(xì)菌屬于化能異養(yǎng)型微生物,不可以只利用無(wú)機(jī)氮源生長(zhǎng),在乳酸發(fā)酵過(guò)程中必須加入菌株生長(zhǎng)所需的氨基酸和維生素才能保證菌株生長(zhǎng)。突變株5E-1在含有11種氨基酸的培養(yǎng)基MCDM4中無(wú)法正常生長(zhǎng)和代謝,外源添加的脯氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸明顯促進(jìn)了菌株生長(zhǎng),說(shuō)明此3種氨基酸是突變株5E-1合成培養(yǎng)基中必不可少的物質(zhì)。

2.1.3 合成培養(yǎng)基MCDM5的驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變株5E-1在MCDM5培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)效果,分別利用全物質(zhì)合成培養(yǎng)基和MCDM5培養(yǎng)基在5 L發(fā)酵罐中對(duì)5E-1進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。從圖2中可以發(fā)現(xiàn),利用MCDM5作為基質(zhì)的5E-1細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)水平與全物質(zhì)合成培養(yǎng)基相差不大,兩種培養(yǎng)基質(zhì)下5E-1的最大細(xì)胞密度(OD620)均達(dá)到8左右,最大乳酸積累量也均達(dá)到30 g/L以上。因此,經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基MCDM5完全可以替代全物質(zhì)合成培養(yǎng)基作為5E-1生長(zhǎng)和代謝的基質(zhì)。

圖2 5E-1分別在MCDM5、全物質(zhì)合成培養(yǎng)基中的批發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Fermentation results of 5E-1 on MCDM5 or complete chemically defined medium

2.2 出發(fā)菌株與突變株利用單一碳源產(chǎn)乳酸情況的對(duì)比考察

突變株5E-1由原始菌株HL5-C通過(guò)ARTP誘變結(jié)合抗葡萄糖阻遏效應(yīng)模型篩選獲得,而且在復(fù)合培養(yǎng)基中具有良好的表現(xiàn),但是在合成培養(yǎng)基中突變株5E-1利用不同碳源的情況仍不甚明晰。本研究在上述合成培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,分別對(duì)原始菌株HL5-C和突變株5E-1利用不同碳源作為底物的情況進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,10種非葡萄糖碳源中有4種糖可被HL5-C單獨(dú)利用,分別是麥芽糖、果糖、甘露糖和半乳糖。相比之下,5E-1則能單獨(dú)利用麥芽糖、低聚異麥芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖和海藻糖這6種非葡萄糖碳源?？梢?jiàn),5E-1能夠比HL5-C利用更多種類的糖,即突變株5E-1的糖代謝譜更廣。

圖3 HL5-C(A)和5E-1(B)利用單一碳源的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of HL5-C(A)and 5E-1(B) using a single carbon source

2.3 出發(fā)菌株與突變株利用混合碳源生產(chǎn)乳酸研究

出發(fā)菌株HL5-C和突變株5E-1在非葡萄糖碳源和葡萄糖組成的混合碳源中的生長(zhǎng)和代謝情況如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以混合碳源為發(fā)酵底物時(shí),原始菌株在葡萄糖存在的前提下對(duì)其他非葡萄糖碳源幾乎不利用,這是因?yàn)槠咸烟谴x引起的分解代謝物阻遏(CCR)效應(yīng)延滯了菌體對(duì)其他糖類的利用[12]。突變株能夠同時(shí)代謝葡萄糖和其他非速效糖類,說(shuō)明突變株5E-1能夠有效緩解葡萄糖分解代謝物阻遏效應(yīng)。在實(shí)際乳酸發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵液中主要?dú)執(zhí)前ó慃溠刻?、麥芽糖和海藻糖[7],而突變株能夠有效地在細(xì)胞利用葡萄糖的同時(shí)消耗這些糖,因此對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)糖含量指標(biāo)的控制具有重要作用。

表3 HL5-C和5E-1利用混合碳源的發(fā)酵結(jié)果Table 3 Fermentation results of HL5-C and 5E-1 with mixed carbon source

注:40 g/L葡萄糖+20 g/L麥芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、異麥芽糖和葡萄糖分別記為G40Mal20、G40Fru20、G40Man20、G40Gal20、G40Tre20、G40Iso20、G40Glu20;/代表未做此組實(shí)驗(yàn),單一碳源利用情況表明HL5-C無(wú)代謝海藻糖和異麥芽糖的能力,因此這兩種糖未納入HL5-C混合碳源實(shí)驗(yàn)。

2.4 抗葡萄糖分解代謝物阻遏效應(yīng)的驗(yàn)證

乳酸發(fā)酵液中的殘?zhí)侵饕獊?lái)自于玉米粉水解過(guò)程,殘?zhí)侵泻孔罡叩某煞譃楫慃溠刻?而異麥芽糖不易被菌體自身代謝,因此在5 L罐中通過(guò)具體考察原始菌株和突變菌株在合成培養(yǎng)基下對(duì)混合碳源(葡萄糖和異麥芽糖)的利用情況,為后續(xù)進(jìn)一步研究突變株抗分解代謝物阻遏的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

HL5-C和5E-1的生長(zhǎng)、異麥芽糖消耗及乳酸生成情況如圖4所示。HL5-C和5E-1的葡萄糖消耗速率分別為2.95和3.34 g/L/h,相比之下,5E-1的最大乳酸積累量略高于HL5-C。與搖瓶發(fā)酵結(jié)果一致,當(dāng)葡萄糖存在時(shí),基質(zhì)中的非速效碳源異麥芽糖明顯被5E-1消耗,利用量為4.07 g/L;而HL5-C中則不存在同時(shí)消耗混合碳源的情況。綜上,突變株5E-1是一株去除或緩解了葡萄糖分解代謝物阻遏的凝結(jié)芽孢桿菌菌株,能夠在利用異麥芽糖的同時(shí)，更快地利用葡萄糖,因此可以作為一株潛在的工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌。

圖4 出發(fā)菌株和突變株5 L罐規(guī)模利用混合碳源發(fā)酵結(jié)果Fig.4 The fermentation results of mutant and parent strains in 5 L bioreactor with mixed carbon source

3 結(jié)論

本文通過(guò)大類物質(zhì)補(bǔ)全添加實(shí)驗(yàn)和單因素添加實(shí)驗(yàn),確定影響HL5-C生長(zhǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)是尿嘧啶,影響5E-1生長(zhǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)是賴氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸,以此篩選得到了分別適合出發(fā)菌HL5-C和突變菌5E-1生長(zhǎng)、代謝的合成培養(yǎng)基MCDM4、MCDM5。HL5-C、5E-1利用單一碳源發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究結(jié)果表明,突變株5E-1的糖代謝譜更廣;兩菌株利用混合碳源發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究發(fā)現(xiàn)5E-1具有抗CCR效應(yīng),即在與葡萄糖等速效碳源共存時(shí),5E-1同時(shí)還可以利用異麥芽糖、果糖等非速效碳源發(fā)酵產(chǎn)酸。突變株5E-1的優(yōu)良發(fā)酵特性—抗CCR效應(yīng)不僅大大縮短了乳酸發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)堑慕到鈺r(shí)間、提高了發(fā)酵效率,也為工業(yè)乳酸發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)墙到夤に嚨膬?yōu)化提供了一種新策略。