陳美玲, 陳 燁, 程玉梅, 朱春玲

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1. 腎內(nèi)科, 2. 重癥醫(yī)學(xué)科, 貴陽550004)

膿毒癥是因嚴(yán)重感染而導(dǎo)致的全身炎癥性反應(yīng)類疾病，即使在重癥監(jiān)護(hù)情況下其發(fā)病后的致死率仍然較高[1]。在被感染時(shí)細(xì)胞因子激活是宿主防御系統(tǒng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。但是大量的細(xì)胞因子激活可能導(dǎo)致全身廣泛損傷和多器官功能衰竭[2]。膿毒癥可上調(diào)一氧化氮(nitric oxide, NO)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性[3,4]。ROS的過量產(chǎn)生可引起因內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)降低和脂質(zhì)過氧化減少而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此認(rèn)為具有抑制ROS和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的藥物可以治療嚴(yán)重的膿毒癥或膿毒癥性休克[5,6]。

天竺葵是可在部分蔬菜和水果中提取出的化合物,主要化學(xué)成分為天竺葵素、天竺葵醇及精油等，具有抗氧化、抗糖尿病和細(xì)胞保護(hù)作用[7]。已有關(guān)于天竺葵抗炎癥反應(yīng)、抗癌癥和預(yù)防糖尿病的研究報(bào)道[8]，但是天竺葵對(duì)膿毒癥患者的腎功能保護(hù)作用尚無明確定論。因此本實(shí)驗(yàn)研究了天竺葵對(duì)膿毒癥模型小鼠的腎保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，(6.2±1.4)周齡，體質(zhì)量(21.4±4.1) g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)[SCXK(黔)2018-0001]，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(黔)2014-002]。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

天竺葵提取物, 購自美國(guó)Sigma公司; 舒泰購自法國(guó)維克制藥股份有限公司; 原發(fā)性人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培養(yǎng)基購于美國(guó)生物科學(xué)公司; 白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶活性(catalase, CAT)試劑盒均購自南京建成生物有限公司; 酶標(biāo)儀購自美國(guó)BioTek公司; 離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠; 電泳儀購自美國(guó)Bio-rad公司。

1.3 小鼠膿毒癥模型制作及實(shí)驗(yàn)處理

將30只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組和天竺葵組, 每組10只。對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng), 不做任何處理; 模型組和天竺葵組小鼠制作膿毒癥模型, 造模成功后, 天竺葵組分別于造模后12 h、60 h注射天竺葵提取物(0.4 mg/kg), 共注射2次。在天竺葵第2次注射后48 h分別收集3組小鼠血液和器官樣品用于功能測(cè)定。

造模方法: 采用盲腸結(jié)扎后穿孔(cecal ligation plus puncture, CLP)手術(shù)制作膿毒癥模型，即將小鼠行腹腔注射麻醉(舒泰30 mg/kg)，在其腹壁正中切口，輕輕拉出盲腸，用無菌4號(hào)絲線在盲瓣于盲腸中點(diǎn)進(jìn)行結(jié)扎，并用無菌針頭在結(jié)扎部位于盲腸頂端的中點(diǎn)處貫穿刺盲腸壁，造成穿孔，輕輕擠壓盲腸，擠出少許內(nèi)容物確保穿孔通暢，然后把盲腸推回腹腔，逐層縫合。

1.4 腎損傷標(biāo)志物檢測(cè)

第2次注射天竺葵后48 h，提取小鼠血液、尿液及腎組織樣本取樣。分別檢測(cè)3組小鼠的血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin, NGAL)、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein, RBP)、N-乙酰 -β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)[9]及24 h蛋白尿水平(小鼠尿液收集方法，小鼠置于代謝籠中，禁食不禁水24 h收集尿液)。

1.5 組織炎癥標(biāo)志物檢測(cè)

分別檢測(cè)3組小鼠血漿中NO、TNF-α、IL-6及髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)水平。其中NO檢測(cè)采用亞硝酸鹽/硝酸鹽測(cè)定, 使用Griess試劑和釩溶液測(cè)定血漿中亞硝酸鹽和硝酸鹽的水平。將每個(gè)樣品(100 μL)與釩溶液(100 μL)混合并與Griess試劑一起孵育。半小時(shí)后，測(cè)量吸光度(A540nm)值。使用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)量最終濃度。TNF-α、IL-6及MPO均采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定, 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)

分別檢測(cè)3組小鼠脂質(zhì)內(nèi)MDA、GSH、SOD、GSH-Px和CAT水平[9,10]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，組間比較的統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)因素方差分析檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠腎臟損傷標(biāo)志物水平比較

與對(duì)照組比較，模型組BUN 、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平均顯著升高(P＜0.05); 天竺葵組BUN、血肌酐、NGAL、RBP及NAG水平顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺葵組BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平顯著降低(P＜0.05)(表1)。

表 1 三組小鼠腎臟損傷標(biāo)志物水平比較

2.2三組小鼠腎組織炎癥標(biāo)志物水平比較

與對(duì)照組比較，模型組及天竺蘭組N O、TNF-α、IL-6及MPO水平均顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺蘭組NO、TNF-α、IL-6及MPO水平均顯著降低(P＜0.05)(表2)。

2.3 三組小鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物比較

與對(duì)照組比較，模型組MDA水平顯著升高，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均顯著降低(P＜0.05); 天竺葵組MDA水平顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺葵組MDA水平顯著降低，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均顯著升高(P＜0.05)(表3)。

表 2 三組小鼠腎組織炎癥標(biāo)志物水平比較

表 3 三組小鼠氧化應(yīng)激標(biāo)志物比較

3 討論

對(duì)人類膿毒癥的研究因復(fù)雜的病理生理學(xué)過程、人群的多樣性、診斷標(biāo)記物的不充足以及倫理限制等多重復(fù)雜原因而受到限制[11,12]。CLP模型被認(rèn)為是多菌膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)模型，可以模擬人類膿毒癥[13]。

BUN 、血肌酐、尿蛋白及LDH是腎損傷檢測(cè)的基礎(chǔ)指標(biāo)。NGAL是急性腎損傷的早期診斷標(biāo)志物, 可用于預(yù)測(cè)慢性腎臟疾病的進(jìn)展; RBP能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，可作為腎功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo), 還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo)。NGAL是一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶，以腎近曲小管含量最高，尿、血清和唾液中NAG活性變化與腎臟狀態(tài)密切相關(guān)。檢測(cè)三組小鼠腎損傷上述標(biāo)志物，結(jié)果表明，天竺葵注射治療能夠顯著降低造模后小鼠BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平。說明天竺葵能夠?qū)δ摱景Y腎損傷起到保護(hù)作用。黨璇等[14]對(duì)天竺葵的藥理活性研究表明, 其具有腎保護(hù)作用。

對(duì)三組小鼠腎組織炎癥標(biāo)志物及氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)表明，天竺葵注射治療能夠顯著降低造模后小鼠炎癥標(biāo)志物NO、TNF-α、IL-6及MPO水平; 提高氧化應(yīng)激標(biāo)志物GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平，降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA水平?；蚓幋a三種抗氧化酶(SOD，CAT和GSH-Px，被認(rèn)為是主要的氧化防御基因[15]。小鼠CLP手術(shù)后降低了腎臟SOD，CAT和GSH-Px的表達(dá)，但是它們通過天竺葵的注射處理后表達(dá)水平較未處理組顯著增加，表明天竺葵具有針對(duì)CLP術(shù)后誘導(dǎo)的腎組織氧化損傷的細(xì)胞保護(hù)活性。CLP還增加腎臟MDA濃度，腎臟MDA是作為主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和氧化應(yīng)激標(biāo)記物[16]。因此，天竺葵可以通過抑制脂質(zhì)中的過氧化反應(yīng)和活化抗氧化酶來保護(hù)免受膿毒癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和損傷。

綜上所述，天竺葵或可用于膿毒癥引發(fā)的腎性疾病的治療。