劉秀琨 ，陳 穎 ，冉 棋，趙卓卓 ，李納納 ，丁 輝，余河水 ，李 薇 ，孟凡英 ，宋新波 ，

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，中藥制藥工程市級實驗教學(xué)示范中心，天津 301617；2.天津中一制藥有限公司，天津 300193）

芍藥-甘草是臨床常用的藥對之一，在許多古方及中成藥制劑中都有應(yīng)用，如芍藥甘草湯、小建中湯、桂枝湯、真人養(yǎng)臟湯等。芍藥-甘草配伍比例不同，功效主治也有差異，化學(xué)物質(zhì)成分也可能存在差異?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥、甘草配伍，可協(xié)同增強抗炎鎮(zhèn)痛和解痙功效[1-2]。藥對研究理論顯示，藥對配合在一起煎煮過程中伴隨復(fù)雜的物理和化學(xué)反應(yīng)，而在一系列變化發(fā)生的同時往往存在化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)換，藥對配伍的化學(xué)成分也不是各單味中藥化學(xué)成分的簡單相加，其療效和化學(xué)變化也不是各味中藥的簡單疊加，而往往是通過中藥化學(xué)成分間發(fā)生復(fù)雜的協(xié)同、拮抗或轉(zhuǎn)性等作用從而達(dá)到藥物增效減毒等目的[3-5]。本研究通過查閱《傷寒論》《金匱要略》《景岳全書》以及《太平惠民和劑局方》古方古籍，統(tǒng)計561方使用芍藥-甘草藥對，配伍比例從 8∶1～1∶8。根據(jù)初步統(tǒng)計結(jié)果，選定16 組配伍比例（1∶0、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5、10∶6、10∶7、10∶8、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8、0∶1），通過測定不同比例芍藥-甘草藥對提取液的pH值、密度、出膏率和6種有效成分的含量綜合探討相關(guān)指標(biāo)隨芍藥-甘草藥對配伍變化規(guī)律，以期為深入探究含有芍藥-甘草藥對的傳統(tǒng)經(jīng)典名方湯劑和經(jīng)典名方顆粒的質(zhì)量控制體系質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

儀器：島津LC-20D型液相色譜儀（日本）、紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）、電熱恒溫干燥箱（天津市天宇實驗儀器有限公司）、煎藥鍋（深圳市正云科技有限公司）等。

藥材：白芍飲片（產(chǎn)地安徽批號180801），甘草飲片（產(chǎn)地新疆批號180801）。

對照品：芍藥苷（98%，批號23180-57-6，中國藥品生物制品鑒定所），芍藥內(nèi)酯苷（98%，批號39011-90-0，Solarbio），氧化芍藥苷（98%，批號1405-86-3，Solarbio），甘草酸（98%，批號 1405-86-3，詩丹德），甘草苷（96.8%，批號 551-15-5，詩丹德），異甘草苷（98%，批號5041-81-6，上海源葉生物科技有限公司）。

試劑：分析純甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠），色譜純甲醇（≥99.9%，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司），乙腈（≥99.9%，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司），磷酸（85%，賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同比例芍藥-甘草的供試品溶液制備 將白芍飲片和甘草飲片，分別按芍藥-甘草 1∶0，10∶1，10∶2，10∶3，10∶4，10∶5、10∶6，10∶7，10∶8，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶6，1∶8和0∶1這16個比例組稱取白芍飲片和甘草飲片共48 g。分別加入25倍量水，煎煮65 min，稠布過濾，各比例組濾液為（560±16）mL，各移取 400 mL濾液濃縮至流動浸膏狀（約80 mL），備用。

2.2 密度、pH值和出膏率的測定與結(jié)果

2.2.1 密度 密度系指在相同的溫度、壓力條件下，某物質(zhì)的密度與水的密度之比。除另有規(guī)定外，溫度為20℃。純物質(zhì)的相對密度在特定的條件下為不變的常數(shù)。因此選擇合適量程的密度儀（1.0～1.1 mg/mL）分別測定16個濾液樣品的密度。

2.2.2 pH值 應(yīng)用pH測量計對16個樣品進(jìn)行測定，現(xiàn)將pH測量計進(jìn)行校準(zhǔn)，由于溶液顯酸性，因此采用二點標(biāo)定法，pH 6.86作為第一點，pH 4.00作為第二點，利用pH測量計分別測定16個提取液pH值。

2.2.3 出膏率 按照2015版《中華人民共和國藥典》附錄收載烘干法測定各比例組浸膏水分，計算出膏率。

2.2.4 密度、pH值、出膏率的結(jié)果 見表1。

由圖1可知，芍藥-甘草提取液的密度和pH與比例沒有明顯關(guān)系，密度變化范圍為1.003±0.002，pH密度變化范圍為4.94±0.11。

由圖2可知，芍藥-甘草提取液在芍藥-甘草配比為 2∶1 時出膏率最低，芍藥-甘草配比為 1∶2～1∶8時，出膏率隨甘草的增加而增加。

2.3 含量測定與結(jié)果

2.3.1 不同比例芍藥-甘草的供試品溶液制備 分別精密稱取不同比例組芍藥-甘草浸膏0.100 0 g置于10 mL容量瓶，用60%甲醇-水溶解，定容，用0.45 μm微孔過濾，取續(xù)濾液用于高效液相色譜儀分析。

表1 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中密度、pH值、出膏率指標(biāo)結(jié)果

圖1 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中密度、pH值

圖2 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中干膏率

2.3.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，甘草苷，異甘草苷和甘草酸5種對照品適量，分別加甲醇制成1.012、1.018、1.012、1.012、1.014 mg/mL的對照品儲備溶液，備用；精密稱取芍藥苷對照品粉末4.13 mg，將其移入5 mL容量瓶中加入甲醇混合均勻即得，分別制成含0.010 mg/mL氧化芍藥苷，0.183 mg/mL芍藥內(nèi)酯苷，0.142 mg/mL甘草苷，0.010 mg/mL異甘草苷，0.316 mg/mL甘草酸，0.826 mg/mL芍藥苷混合對照品溶液。

2.3.3 色譜條件 采用Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脫：0～8 min，14%～19%B；8～20 min，19%～28%B；20～25 min，28%～35%B；25～30 min，35%～45%B；30～40 min，45%～95%B；流速1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫30℃。進(jìn)樣體積 30 μL。

2.3.4 專屬性實驗 分別將單味藥芍藥和甘草供試樣品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件分別進(jìn)行分析，結(jié)果在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置無色譜峰，說明單味藥芍藥和甘草不影響測定（圖5）。

2.3.5 方法學(xué)考察

2.3.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取上述混合對照品溶液 5、10、15、20、30 μL 注入高效液相色譜儀（HPLC），測定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，結(jié)果見表2。

2.3.5.2 精密度實驗 精密吸取供試品溶液（芍藥∶甘草為 1∶1）30 μL，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，精密度試驗中1～6個標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積RSD值分別為：1.4%，1.73%，2.97%，2.74%，2.68%和2.11%（n=6），結(jié)果表明，儀器精密度較好。

表2 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中6種成分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.3.5.3 重復(fù)性實驗 精密吸取供試品溶液30 μL（芍藥∶甘草為 1∶1），按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，重復(fù)性試驗中1～6個標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積RSD值分別為：1.28%、1.59%、2.71%、2.78%、2.43%和1.86%，

2.3.5.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，在室溫下放置，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣 30 μL 分析，測定峰面積。穩(wěn)定性試驗1～6個標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積RSD值分別為：2.52%、2.83%、2.64%、2.71%、1.81%和2.10%。

2.3.5.5 加樣回收率實驗 精密吸取已測得含量的芍藥∶甘草（1∶1）提取液 4 mL，平行精密吸取 6 份，分別加入等量混合對照品溶液，制成供試溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定分析，得到氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、異甘草苷、甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為99.32%、99.68%、99.85%、100.45%、100.75%和 98.70%，RSD值分別為：2.85%、2.73%、1.84%、1.72%、1.65%和1.32%。

表3 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中6種成分含量

2.3.5.6 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果 由圖3和4可知，氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的溶出率呈無規(guī)律變化。芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的變化趨勢相似，芍藥內(nèi)酯苷在比例組1∶3時溶出率達(dá)到最大值，芍藥苷在1∶6比例時達(dá)到最大值。芍藥內(nèi)酯苷在10∶4時達(dá)到最低值，而芍藥苷在10∶3時達(dá)到最低值。異甘草苷、甘草苷和甘草酸的溶出率呈無規(guī)律變化，甘草苷和甘草酸的變化趨勢相近。在芍藥-甘草比例為1∶1時，異甘草苷、甘草苷和甘草酸溶出率均最低，在芍藥-甘草比例為1∶2和1∶6時，異甘草苷、甘草苷和甘草酸溶出率均較高。

3 結(jié)論與討論

3.1 芍藥-甘草不同比例提取液常規(guī)參數(shù)的影響芍藥-甘草不同比例提取液的密度和pH與比例大小沒有明顯關(guān)系，密度變化范圍為1.003±0.002，pH密度變化范圍為4.94±0.11，提取液呈酸性。在含有芍藥-甘草的經(jīng)典名方或復(fù)方的質(zhì)量控制指標(biāo)成分選擇時，注意方中堿性藥味的影響。芍藥-甘草不同比例煎煮過程中，出膏率整體變化趨勢不大，變化范圍為15.39±1.70，這為進(jìn)行經(jīng)典名方芍藥甘草湯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的常規(guī)參數(shù)研究提供依據(jù)。

3.2 芍藥-甘草不同比例提取液化學(xué)成分的影響 芍藥-甘草不同比例組煎煮過程化學(xué)成分的溶出率結(jié)果顯示：芍藥中主要活性成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的溶出率呈無規(guī)律變化，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的變化趨勢較為接近，其中芍藥-甘草比例為1∶3時，芍藥內(nèi)酯苷溶出率最高，芍藥-甘草比例為1∶6時，芍藥苷溶出率最高；甘草中主要活性成分異甘草苷、甘草苷和甘草酸的溶出率亦無明顯規(guī)律，而甘草苷和甘草酸的變化趨勢相近，其中芍藥-甘草比例為10∶3時，甘草苷溶出率最高，芍藥∶甘草為1∶2時，甘草酸溶出率最高。芍藥-甘草配比為1∶3～1∶8組，甘草明顯促進(jìn)芍藥中的芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的溶出。鑒于以上結(jié)果，進(jìn)行經(jīng)典名方芍藥甘草湯以及含有芍藥-甘草藥對的復(fù)方質(zhì)量控制指標(biāo)Q-Marker研究可考慮選擇芍藥藥味中的芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，甘草藥味中甘草苷和甘草酸。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的芍藥-甘草藥對提取物的入血成分相一致[6-7]。

圖3 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中芍藥中成分的溶出率

圖4 不同比例芍藥-甘草藥對提取液中甘草中成分的溶出率

圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品（A）、白芍水煎液（B）、甘草水煎液（C）、芍藥甘草湯比例水煎液（D）的HPLC圖譜

3.3 芍藥-甘草不同比例提取液煎煮方法的選擇 芍藥-甘草不同比例組煎煮方法與煎煮時間是參考張仲景《傷寒論》的芍藥甘草湯（芍藥-甘草比例為1∶1）的制法進(jìn)行16個比例組進(jìn)行煎煮，并選擇相同廠家相同型號的煎藥鍋，盡可能保證各比例組的制法一致，可避免產(chǎn)生操作誤差。

3.4 芍藥-甘草不同比例提取液色譜條件的選擇 色譜條件篩選實驗對比研究了乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%甲酸水溶液，甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-水等溶劑的分離結(jié)果，結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速1 mL/min，柱溫30℃條件下分離效果最好，色譜峰分布均勻，基線穩(wěn)定。