郜偉，周文麗，崔瑞瑞，楊松林，高英

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384）

復(fù)幼是指將成熟老態(tài)的細(xì)胞或者器官恢復(fù)到幼嫩狀態(tài)的重要技術(shù)手段[1]，植物是否幼嫩對其生長發(fā)育等多個方面有著重要的影響，包括植物的生根能力、生長態(tài)勢、通直生長狀態(tài)、繁殖能力、以及對惡劣環(huán)境的抵抗程度等[1]。通常情況下，植物幼態(tài)時期的生根能力和繁殖能力極強(qiáng)，但是隨著植物的生長發(fā)育，生根能力和繁殖能力會逐漸降低[2]。因此采取一定的科學(xué)技術(shù)手段對植物進(jìn)行復(fù)幼生長，其對木本植物的繁殖具有重大意義。自1954年人們發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)常春藤復(fù)幼開始，木本植物的復(fù)幼技術(shù)便受到了極大的關(guān)注[3]，科學(xué)家在復(fù)幼領(lǐng)域開展了大量的研究，對植物器官的表觀特征、細(xì)胞的顯微、亞顯微結(jié)構(gòu)、生理代謝變化、基因表達(dá)等各個領(lǐng)域都進(jìn)行了探討和研究，并取得了一些成果[4-8]。

珠美海棠（Malus zumi）是薔薇科蘋果屬植物，具有極強(qiáng)的抗寒能力和耐鹽堿性質(zhì)，同時也具有較強(qiáng)的耐旱性[9-10]，可以在寒冷地區(qū)和鹽堿地區(qū)廣泛種植。且樹形優(yōu)美漂亮，是一種經(jīng)濟(jì)實用的觀賞性樹木。同時，珠美海棠與多種蘋果品種嫁接，可在大多數(shù)的鹽堿地區(qū)栽培，對于擴(kuò)大蘋果樹的栽種面積，提高蘋果品質(zhì)具有極大的意義。本研究通過珠美海棠組培復(fù)幼研究，對于提高其繁殖能力和繁殖系數(shù)方面具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以天津農(nóng)學(xué)院實驗樓前的成齡珠美海棠為母樹，采集半木質(zhì)化的枝條作為初代組培苗進(jìn)行復(fù)幼組織培養(yǎng)的外植體。采集繼代次數(shù)為 0（外植體上的葉片）代，1、3、5、7代在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d的植株葉片放入自封袋中，并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 珠美海棠的組織培養(yǎng)

以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，從樹齡相同的多年生珠美海棠母樹上選取長勢相同的當(dāng)年生枝條的莖尖做為組培的外植體，建立無菌體系。之后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基仍以 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入2 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，每次繼代時間為30 d，每次繼代取前一次繼代增殖產(chǎn)生的莖段為材料，連續(xù)繼代7次，觀察復(fù)幼增殖的情況，并取樣進(jìn)行生理指標(biāo)的測定和組織結(jié)構(gòu)的觀察。

1.2.2 可溶性糖含量的測定

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[11]，用電子天平精準(zhǔn)地稱量各代珠美海棠的葉片0.5 g，每種植物葉片各稱取3份進(jìn)行重復(fù)，剪碎混勻后分別放入大試管中，每只試管加入15 mL蒸餾水，然后在沸水浴中煮沸20 min后取出冷卻，將冷卻后的液體過濾倒入100 mL的容量瓶并定容。測量時取1 mL提取液加入蒽酮試劑（50 mL水中緩慢倒入200 mL 98%濃硫酸，待完全冷卻后加入0.05 g蒽酮）5 mL，在620 nm波長下用空白調(diào)零，測定其吸光度值。

1.2.3 可溶性蛋白的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定葉片中蛋白質(zhì)的含量[11]。

酶液蛋白質(zhì)含量（mg/g FW）=C×V/W×a

C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）；V為提取液總體積（mL）；a為測定所取提取液體積（mL）；W為取樣量（g）。

1.2.4 組織結(jié)構(gòu)的觀察

利用石蠟切片法進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)的觀察。石蠟切片制備按常規(guī)方法進(jìn)行，取材料放入FAA固定液中，固定24 h以上。固定后的材料利用梯度酒精進(jìn)行逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。之后進(jìn)行修塊，用切片機(jī)切片，烘箱烘干，二甲苯脫蠟，梯度酒精逐級復(fù)水，進(jìn)行番紅染色6～8 h，蒸餾水漂洗，70%、80%、95%酒精各脫水1 min，固綠染色1 min，95%酒精、無水乙醇、酒精二甲苯混合液各2 min，二甲苯5 min，脫水透明處理。中性樹脂膠封片，電子顯微鏡下觀察，并拍照記錄不同放大倍數(shù)下莖、葉結(jié)構(gòu)圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同代數(shù)珠美海棠葉片中可溶性蛋白含量的變化

由圖1可知，0代珠美海棠中可溶性蛋白含量為0.033 mg/g；1代珠美海棠中可溶性蛋白的量為0.034 mg/g；之后隨繼代次數(shù)的增加，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，繼代培養(yǎng)第7代時珠美海棠中可溶性蛋白的含量最低，為0.027 mg/g。但培養(yǎng)5代之前各代的可溶性蛋白含量差異不顯著，第 7代與其他各代相比可以達(dá)到顯著水平。

圖1 復(fù)幼后各代珠美海棠葉片中可溶性蛋白含量

2.2 不同代數(shù)珠美海棠葉片可溶性糖含量的變化

通過試驗對復(fù)幼后各代珠美海棠葉片內(nèi)可溶性糖含量測定，并進(jìn)行顯著性分析，其含量變化如圖2所示。從圖中可知，0代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.006 8 g/100g；1代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.007 2 g/100g；隨繼代次數(shù)的增加可溶性糖含量逐漸遞減，第7代珠美海棠葉中可溶性糖含量為0.006 1 g/100g，達(dá)到各代培養(yǎng)的最低水平。分析可知，0代和3代之間沒有顯著性差異；5代和7代之間沒有顯著性差異；0代和1代之間具有顯著性差異且1代中含量比0代中的含量略有增加。從整體上看，復(fù)幼后珠美海棠葉片中的可溶性糖含量呈現(xiàn)減少趨勢。

圖2 復(fù)幼后各代珠美海棠葉片中可溶性糖含量

2.3 不同繼代次數(shù)組培苗葉片及莖的組織結(jié)構(gòu)比較

2.3.1 不同繼代次數(shù)組培苗葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

圖3為不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗葉片的組織結(jié)構(gòu)橫切圖。如圖3可知，0代、1代柵欄組織明顯，1代較0代的柵欄組織減少，3代和5代柵欄組織明顯較0代和1代減少，但仍能觀察到柵欄組織，7代柵欄組織最少，較難觀察。各繼代次數(shù)葉片海綿組織沒有明顯變化。0代、1代上表皮細(xì)胞排列整齊且細(xì)胞壁較厚，3代、5代、7代上下表皮細(xì)胞均有增大，表皮細(xì)胞壁變薄。維管組織0代葉最發(fā)達(dá)，隨著繼代次數(shù)的增加，維管束在葉中所占比例減小。

圖3 不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗葉橫切面結(jié)構(gòu)圖

2.3.2 不同繼代次數(shù)組培苗莖組織結(jié)構(gòu)的變化

圖4為不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗莖橫切面結(jié)構(gòu)圖。由圖4可以看出，0代莖橫切顯微結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞排列緊密整齊，表皮細(xì)胞壁較厚，皮層薄壁細(xì)胞小且較少，木質(zhì)部明顯排列緊密整齊，木質(zhì)化程度較高，韌皮層較寬，髓部細(xì)胞形狀較規(guī)則，髓射線較清晰。1代莖與0代相比，表皮細(xì)胞壁變薄，皮層薄壁細(xì)胞增多，木質(zhì)部明顯減少且排列疏松，木質(zhì)化程度降低，韌皮部沒有明顯變化。3代、5代、7代莖表皮細(xì)胞壁變薄，表皮細(xì)胞增大，皮層薄壁細(xì)胞增大，細(xì)胞層增厚，木質(zhì)部減少，細(xì)胞排列疏松，韌皮層稍有減少。髓細(xì)胞形狀不規(guī)則，髓射線不明顯。

圖4 不同繼代次數(shù)珠美海棠組培苗莖橫切面結(jié)構(gòu)圖

3 討論

3.1 組培復(fù)幼對植物葉片中可溶性糖的影響

植物器官內(nèi)可溶性糖的變化會對植物葉片的生理適應(yīng)性產(chǎn)生一系列的影響，主要表現(xiàn)在抗寒、抗旱、耐鹽堿等對不良環(huán)境的抵抗能力等方面[12-15]。復(fù)幼后珠美海棠葉片中的可溶性糖經(jīng)過測定和顯著性差異分析可知:0代和 3代間沒有顯著性差異；0代和1代之間具有極顯著性差異，且呈現(xiàn)增加趨勢；5代、7代和0代相比具有極顯著性差異；5代和7代之間沒有顯著性差異；從總體上來看，葉片中可溶性糖含量1代與0代相比為增加，而自第3代開始，逐代呈下降趨勢。文佳等研究了樹齡對油茶葉中可溶性糖的含量變化，表明隨著樹齡的增加葉片中可溶性糖的含量顯著增加[16]，本試驗結(jié)果表明，珠美海棠葉片內(nèi)的可溶性糖含量隨繼代次數(shù)的增加而降低，這和前人研究的變化結(jié)果相符。但在本試驗中復(fù)幼第1代珠美海棠葉片中的可溶性糖含量出現(xiàn)一次上升，導(dǎo)致這種情況的具體原因尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 組培復(fù)幼對植物葉片中可溶性蛋白的影響

植物體內(nèi)可溶性蛋白的含量與植物的抗寒性有很大的關(guān)聯(lián)，可溶性蛋白的含量和植物抗寒能力強(qiáng)弱呈現(xiàn)正比關(guān)系[17]。復(fù)幼后各代珠美海棠葉片中的可溶性蛋白含量幾乎沒有顯著性差異，直到復(fù)幼到第7代時葉片內(nèi)的可溶性蛋白才與0代中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)顯著性差異。根據(jù)本試驗的數(shù)據(jù)推測，復(fù)幼對珠美海棠葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量變化影響不大，且變化趨勢不明顯。也可能是由于本試驗中復(fù)幼代數(shù)較少，未能得出復(fù)幼與可溶性蛋白含量變化之間的關(guān)系。

3.3 不同繼代次數(shù)對組培苗組織結(jié)構(gòu)的影響

刁俊明等[7]在研究不同樹齡桐花樹葉片組織結(jié)構(gòu)時，將葉片海綿組織厚度、柵欄組織厚度、葉面長寬比等作為指標(biāo)。結(jié)果顯示，隨樹齡的增加，葉片的柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度均呈先降后升趨勢。本試驗珠美海棠葉片結(jié)構(gòu)隨繼代次數(shù)的增加?xùn)艡诮M織逐漸減少，排列逐漸疏松，海綿組織沒有明顯變化，葉上下表皮細(xì)胞有增大趨勢，表皮細(xì)胞壁變薄。柵欄組織變化與刁俊明試驗結(jié)果相似，但海綿組織無明顯變化。Amissah等[18]在研究莖的結(jié)構(gòu)與生根能力之間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)連續(xù)的厚壁組織會阻止不定根的發(fā)生，而幼態(tài)的莖結(jié)構(gòu)中厚壁組織不連續(xù)，因此生根能力較高。Ballerster[8]在研究板栗幼齡期和成熟期體外生根過程莖顯微結(jié)構(gòu)變化中，幼體和成熟枝條在切除時具有相似的莖結(jié)構(gòu)，主要區(qū)別在于木質(zhì)部和韌皮部在成熟期比幼齡期發(fā)育得更好。本試驗結(jié)果與上述結(jié)果趨于一致，0代有較厚的表皮細(xì)胞壁，且木質(zhì)部發(fā)達(dá)，細(xì)胞排列緊密。隨繼代次數(shù)增加表皮細(xì)胞壁變薄，木質(zhì)部排列變疏松。

4 結(jié)論

通過本研究可知，隨著繼代次數(shù)的增加，珠美海棠復(fù)幼程度呈現(xiàn)逐漸加劇趨勢。因此，組培繼代培養(yǎng)可以實現(xiàn)苗木復(fù)幼的目的，對優(yōu)質(zhì)苗木的生產(chǎn)具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。