連朋，杜夢(mèng)卿，王麗娟

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津300384）

我國(guó)草莓（Fragaria ananassaDuchesne）總產(chǎn)量和栽培面積位居世界第一[1]，其市場(chǎng)需求量巨大，在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中草莓育苗多采用匍匐莖繁殖，這種方法易使草莓感染病菌，導(dǎo)致種性退化，果實(shí)變小，畸形果比例增多，口感逐漸變差等[2]，目前，組培快繁技術(shù)是解決這一問(wèn)題的有效途徑之一。關(guān)于草莓組培快繁研究的較多，例如Ko等以‘桃園1號(hào)’等臺(tái)灣品種草莓的莖尖為外植體，利用次氯酸鈉對(duì)剝開(kāi)外葉包裹的莖尖進(jìn)行消毒，成活率超過(guò)了80%[3]；Paredes以智利草莓莖尖為外植體，利用酒精、抗氧化劑和次氯酸鈉消毒，污染率可小于20%，將莖尖接種在含有6-芐氨基腺嘌呤＋吲哚丁酸的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)率達(dá)到80%，后期增殖系數(shù)達(dá)到10以上，生根率達(dá)到90%[4]；田芳等以‘章姬’草莓莖尖為外植體，利用酒精、升汞消毒，在MS＋6-BA＋NAA培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)率為 56.7%，最高增殖系數(shù)達(dá)到5.5，生根率達(dá)到95%[5]，以及楊波等[6]利用‘京藏香’草莓和張黎鳳等[7]利用‘紅顏’草莓進(jìn)行草莓組培試驗(yàn)，采用的消毒方法和激素處理均有所偏差。根據(jù)前人研究結(jié)果來(lái)看，在外植體消毒和植物激素濃度配比等方面存在較大差異，其原因可能與不同基因型草莓品種存在差異所致。

因此，本試驗(yàn)試材為引進(jìn)的日本草莓品種‘香野’，取其莖尖為外植體，通過(guò)對(duì)外植體消毒處理、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等階段進(jìn)行研究，篩選出外植體的最佳消毒方法，分析比較不同培養(yǎng)階段激素的適宜添加量，為解決草莓種性退化、拓寬品種組培關(guān)鍵技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用草莓莖尖取自天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地。次氯酸鈉（NaClO）、噻苯?。═DZ）、萘乙酸（NAA）及MS培養(yǎng)基所需各種化學(xué)物質(zhì)，均由天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院設(shè)施實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒

取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的草莓匍匐莖（留取頂端2～4 cm）于燒杯中，加入少量洗衣粉和水浸泡 5 min后，置于流水沖洗 0.5 h，加 2～3滴Tween-80浸泡5 min，再用流水沖洗0.5 h，將沖洗干凈的匍匐莖轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌水沖洗3次，75%乙醇浸泡消毒30 s后無(wú)菌水沖洗3次。用2%、5%、10%次氯酸鈉（NaClO）浸泡消毒5、10、15 min，9個(gè)處理標(biāo)記為H1～H9，消毒后用無(wú)菌水沖洗4次。剝?nèi)∫严竞玫馁橘肭o生長(zhǎng)點(diǎn)（0.3～0.5 mm），接種于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（MS＋TDZ 1.0 mg/L＋NAA 0.1mg/L＋瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8）上，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個(gè)莖尖。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為（25±1）℃，光照時(shí)間設(shè)置為16 h/d，光照強(qiáng)度設(shè)置為 39.49 μmol/（m2·s）。

污染率＝污染莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

褐化率＝褐化莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

成活率＝誘導(dǎo)成活莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

1.2.2 誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

剝?nèi)⊥ㄟ^(guò) H7處理方法已消毒好的匍匐莖生長(zhǎng)點(diǎn)接種于添加不同濃度TDZ（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）和0.1 mg/L NAA的MS誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8），6個(gè)處理標(biāo)記為T(mén)1～T6。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個(gè)莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)莖尖誘導(dǎo)分化率、生長(zhǎng)勢(shì)。生長(zhǎng)勢(shì)由最早誘導(dǎo)分化時(shí)間以及分化芽數(shù)決定[8]。

誘導(dǎo)分化率＝萌發(fā)芽的莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100%

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

把誘導(dǎo)分化出的草莓叢生芽切分開(kāi)，接種于添加不同濃度 TDZ（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L）和0.2 mg/L NAA的MS繼代增殖培養(yǎng)基（瓊脂7 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 5.8）上，6個(gè)處理記為Q1～Q6。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種3個(gè)莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的增殖系數(shù)及生長(zhǎng)勢(shì)。

增殖系數(shù)＝接種培養(yǎng)30 d后叢生芽總數(shù)／接種初期叢生芽總數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)

將3～4 cm生長(zhǎng)健壯的草莓組培苗轉(zhuǎn)接到MS和 NAA含量不同的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)（表1），其中瓊脂為7 g/L，蔗糖為30 g/L，pH 5.8。每個(gè)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種4個(gè)莖尖。接種培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理的生根率、根部干鮮重及根系活力。

表1 生根培養(yǎng)基配方

生根率＝接種30 d的生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

根系活力采用TTC法測(cè)量[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)外植體消毒效果的影響

不同消毒處理對(duì)外植體消毒效果的影響情況見(jiàn)表2。外植體的污染率隨次氯酸鈉濃度的增加及消毒時(shí)間的增加而降低，其中H1處理的污染率極顯著高于其他處理，H9處理的污染率極顯著低于其他處理。外植體的褐化率隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時(shí)間的增加而升高，其中H1處理的褐化率與 H2處理差異不顯著，顯著低于其他處理， H9處理的褐化率極顯著高于其他處理。H7、H4、H5處理成活率顯著高于其他處理，3個(gè)處理在污染率方面，H4處理極顯著高于H7處理，與H5處理差異不顯著，H5處理顯著高于H7處理；褐化率方面，H7處理顯著高于 H4處理，與 H5處理差異不顯著；成活率方面，H7處理成活率最高，達(dá)到64.44%，但3個(gè)處理間差異不顯著。

表2 不同消毒處理對(duì)外植體消毒效果的影響

2.2 不同激素處理對(duì)草莓莖尖誘導(dǎo)分化的影響

不同濃度激素處理對(duì)草莓莖尖誘導(dǎo)分化的影響見(jiàn)表3。

表3 不同激素配比對(duì)莖尖誘導(dǎo)分化的影響

由表3可知，隨著TDZ濃度的升高，外植體誘導(dǎo)分化率升高，分化速度加快，但是長(zhǎng)勢(shì)減弱。T3、T4、T5、T6處理的誘導(dǎo)分化率均極顯著高于T1、T2處理；T4處理的誘導(dǎo)分化率顯著高于其他處理，達(dá)到67.78%，且莖尖分化快，芽數(shù)多，長(zhǎng)勢(shì)較旺盛；T5、T6處理的莖尖分化速度快，分化芽數(shù)多，長(zhǎng)勢(shì)弱；T3處理的莖尖分化速度快，分化芽數(shù)較多，長(zhǎng)勢(shì)旺盛；T2處理的莖尖分化慢，分化芽數(shù)較少，長(zhǎng)勢(shì)較旺；T1處理的莖尖分化慢，芽數(shù)少，長(zhǎng)勢(shì)最弱。因此通過(guò)誘導(dǎo)分化率和生長(zhǎng)勢(shì)確定草莓外植體誘導(dǎo)分化最適宜培養(yǎng)基配方為MS＋TDZ 1.00 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，該處理下誘導(dǎo)分化率達(dá)67.78%。

2.3 不同激素處理對(duì)草莓叢生芽繼代增殖的影響

不同激素處理對(duì)草莓叢生芽繼代增殖的影響情況見(jiàn)表4。

表4 不同激素配比對(duì)莖尖繼代增殖的影響

由表4可見(jiàn)，隨著TDZ濃度升高，叢生芽增殖數(shù)量增多，增殖系數(shù)增大，長(zhǎng)勢(shì)越旺，但是TDZ濃度達(dá)到1.0 mg/L，組培苗長(zhǎng)勢(shì)開(kāi)始減弱并且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。Q6處理的增殖系數(shù)極顯著高于其他處理，但是該處理組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱，玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重；Q5處理的增殖系數(shù)顯著高于Q4、Q3、Q2、Q1處理，但該處理長(zhǎng)勢(shì)弱并且玻璃化現(xiàn)象明顯；Q4、Q3處理的增殖系數(shù)顯著高于Q2、Q1處理，且二者之間差異不顯著，Q4處理長(zhǎng)勢(shì)旺但有玻璃化現(xiàn)象，Q3處理長(zhǎng)勢(shì)旺且沒(méi)有玻璃化現(xiàn)象；Q2、Q1處理的增殖系數(shù)極顯著小于其他處理。因此，通過(guò)增殖系數(shù)和生長(zhǎng)勢(shì)確定草莓叢生芽增殖最適宜培養(yǎng)基配方為 MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，該處理下增殖系數(shù)達(dá)到4.11，且長(zhǎng)勢(shì)旺盛。

2.4 不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對(duì)草莓組培苗生根培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對(duì)草莓生根培養(yǎng)的影響情況見(jiàn)表5。不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度處理下組培苗生根率大小依次是 Z2＞Z6＞Z5＞Z4＞Z1＞Z3，其中 Z2處理顯著高于其他處理，為98.33%；在根鮮重、根干重、根系活力方面，Z2處理均極顯著大于其他處理，其中生長(zhǎng)于添加NAA培養(yǎng)基上的組培苗，即 Z2、Z4、Z6處理的根鮮重、根干重、根系活力顯著高于生長(zhǎng)于未添加NAA培養(yǎng)基的組培苗即Z1、Z3、Z5處理。因此最適宜草莓組培苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基是 MS＋NAA 0.1 mg/L，該處理下草莓組培苗生根率達(dá)到98.33%。

表5 不同培養(yǎng)基濃度及激素濃度對(duì)生根培養(yǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以‘香野’草莓匍匐莖為試驗(yàn)試材，研究了其組培快繁技術(shù)。含氯消毒劑在水中形成次氯酸，作用于菌體蛋白質(zhì)起到消毒作用，而氯化汞是劇毒化學(xué)藥品，會(huì)給環(huán)境造成較大污染[10]，因此本試驗(yàn)采用次氯酸鈉作為消毒劑。外植體消毒結(jié)果表明，以草莓莖尖為外植體，采用10%次氯酸鈉浸泡消毒5 min，可以有效減小污染率和褐化率，且成活率最高為64.44%。外植體的污染率隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時(shí)間的增加而降低，而褐化率則隨著次氯酸鈉濃度的增加以及消毒時(shí)間的增加而升高，該試驗(yàn)結(jié)果與張付遠(yuǎn)等[10]采用氯化汞消毒所得結(jié)果相同，次氯酸鈉在殺死菌體的同時(shí)也使莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)失活，因此掌控好消毒劑濃度及消毒時(shí)間是外植體消毒的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)結(jié)果表明，草莓外植體誘導(dǎo)分化最適宜培養(yǎng)基配方為 MS＋TDZ 1.00 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，此時(shí)的誘導(dǎo)率是67.78%。李海玲等[11]以‘紫金四季’草莓葉片為外植體，得出最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是MS＋TDZ 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，即適宜不同外植體誘導(dǎo)分化的激素濃度不同，由于葉片分化程度高，適宜誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分裂素濃度也相應(yīng)的高。本試驗(yàn)中將試驗(yàn)試材接種于含更高濃度TDZ的培養(yǎng)基上時(shí)，誘導(dǎo)分化率增加，但組培苗長(zhǎng)勢(shì)弱，而將長(zhǎng)勢(shì)弱的組培苗轉(zhuǎn)接于低濃度的TDZ培養(yǎng)基或增加NAA濃度的培養(yǎng)基上后，組培苗長(zhǎng)勢(shì)逐漸增強(qiáng)，推測(cè)是高濃度的TDZ會(huì)阻礙組培苗吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，或者高濃度的TDZ會(huì)降低組培苗的生理活性。

本試驗(yàn)中繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果表明，MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L是最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)4.11。而翟婷婷等研究‘紅顏’的增殖系數(shù)為3.75[12]，所以增殖系數(shù)與品種的不同及激素的差異有關(guān)。該試驗(yàn)中Q6處理增殖系數(shù)顯著高于其他處理，但是該處理組培苗玻璃化現(xiàn)象也最為嚴(yán)重，因此提出及時(shí)轉(zhuǎn)接補(bǔ)救措施。胡穎[13]研究表明，培養(yǎng)基中瓊脂濃度、激素濃度、碳源濃度、銨根離子濃度以及培養(yǎng)箱的溫度、光照和濕度，培養(yǎng)瓶的封口膜透性也是影響草莓組培苗玻璃化率的重要影響因子。因此進(jìn)一步探究‘香野’草莓組培苗出現(xiàn)的玻璃化原因及其逆轉(zhuǎn)復(fù)壯措施，將是該組培快繁技術(shù)改良的內(nèi)容之一。

生根培養(yǎng)結(jié)果表明，MS＋NAA 0.1 mg/L是最適宜的生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)到98.33%。本試驗(yàn)中MS、3/4MS和1/2MS培養(yǎng)基均能很好地誘導(dǎo)草莓組培苗根系的產(chǎn)生，這與翟婷婷等[12]研究中草莓組培苗容易生根的結(jié)論相同。翟婷婷等[12]以‘豐香’和‘章姬’草莓為試驗(yàn)材料，1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L IBA生根效果最優(yōu)；夏瑾等[14]以‘寧玉’草莓為試驗(yàn)材料，1/2MS培養(yǎng)基中添加0.05 mg/L NAA生根效果最優(yōu)，而本試驗(yàn)以‘香野’草莓為試驗(yàn)材料，MS培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA生根效果最優(yōu)，說(shuō)明品種不同，最適合的生根培養(yǎng)基激素配比也不同。

綜合以上研究得出，‘香野’草莓莖尖組培中，消毒劑次氯酸鈉最適濃度為10%，最適消毒時(shí)間為5 min，最適宜莖尖誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基為 MS＋TDZ 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，最適宜叢生芽繼代增殖的培養(yǎng)基為MS＋TDZ 0.75 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最適宜組培苗生根的培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.1 mg/L。