李瀟男 關國榮 劉憶琨 梁浩文 張愛琴 周建英?

1)(中山大學,光電材料與技術國家重點實驗室,廣州 510275)

2)(中山大學電子與信息工程學院,廣州 510275)

針對超分辨領域分辨率測量標準的缺失情況,本文介紹了一種用于納米尺度分辨率測試的標準樣品的設計方案和制備方法,該樣品適用于矢量光共聚焦激光掃描顯微系統(tǒng).該設計方案包含一系列測量圖案和明確的指示標記,具有測量范圍寬、線寬梯級序列分布合理、制備精度高等特點.首先在非晶硅片上實現(xiàn)硅納米標準樣品的制備,并經過多次探索工藝,提高了測試圖案的精度.光學測試結果證實該納米標樣可用于分辨率測試,同時測得矢量光共聚焦激光掃描顯微鏡的分辨率為96 nm (n=1.52,405 nm光源).針對硅納米標準樣品低對比度的問題,本文提供石英片上金屬納米標準樣品的制備方法作為補充.納米標準樣品的實現(xiàn),為點掃描式超分辨顯微鏡的分辨率指標提供了一種更嚴謹?shù)臏y試途徑,同時能夠為顯微鏡的調試提供原理性指導.測試中發(fā)現(xiàn)納米尺度的光學成像效果除了受到樣品形貌的影響外,還受到到樣品的光電物性的影響,其相互作用機理尚待進一步深入研究.

1 引 言

自光學顯微鏡問世以來,顯微鏡性能的提高就成為備受關注的研究課題.在過去的幾十年里,為了突破衍射極限[1],人們發(fā)明了一系列的遠場超分辨光學顯微技術,如受激輻射損耗顯微鏡、結構光照明顯微鏡、光激活定位顯微鏡和隨機光學重構顯微鏡等,這些超分辨技術依賴于特殊的熒光標記蛋白和復雜的光路,可以達到50 nm甚至20 nm的分辨率[2,3].利用特殊的透鏡或者探針,近場顯微技術[4]也可以實現(xiàn)突破衍射極限的目的.

除此之外,共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)因具有高分辨率與深度選擇性也得到廣泛應用[5].相對于其他方法,它結構簡單、非侵入式、無需樣品的先驗知識,因此適用于大多數(shù)樣品,在生物活體研究方面有很大優(yōu)勢.不過,在一般條件下(空氣環(huán)境中或油浸),它的分辨率只達到180 nm左右,不及幾種常用的熒光超分辨顯微技術.近年來,有不少關于柱對稱矢量光場的研究提供了提高CLSM分辨率的方法.利用經空間調制的徑向偏振光可以得到一個更小的聚焦光斑,適用于空氣中、液體浸潤和固體浸潤環(huán)境中[6-9].文獻[10]采用532 nm波長的高對稱徑向偏振光場為激發(fā)光源,通過光場調控實現(xiàn)矢量光場CLSM的點擴散函數(shù)的約束,實現(xiàn)了115 nm的分辨率,比一般的共聚焦顯微鏡提高了不少.該結果是在納米鋁三角島樣品上一個尖角處測得的,與許多文獻用到的分辨率測試方法類似[3,10-15],都是對分散的粒子或單一結構成像,再根據結果算出該顯微鏡的分辨率.這種測試方法只能說明顯微鏡有能力分辨某一大小的物體或者某給定間隔的兩個物體,無法提供足夠多的數(shù)據進行對比,也無法精確地描述超分辨顯微鏡的分辨率,故需要足夠精確與嚴謹?shù)姆椒ㄓ糜跍蚀_檢測矢量光場CLSM的分辨率.此外,在矢量光場CLSM中,矢量光場可以提供高對稱度的激發(fā)與探測方式[6],避免線性偏振光場的非對稱聚焦光斑[16],在這種情況下,更需要標準樣品來檢測各個方向上的偏差,以保證光路中光場的高對稱度,從而減小實驗誤差.人們在檢測攝像機或傳統(tǒng)光學顯微鏡的最佳分辨率時,常用推薦性國家標準GB/T 6161-2008 (等同于ISO 3334:2006標準)中的ISO 2號解像力測試圖進行測試[17],該解像力測試圖由一系列測試圖樣組成,單個測試圖樣包含兩組相互垂直的平行線段,每一組5條線段,線段的線寬與間隔等寬.該標準以測試圖樣的5條線段能否全部被辨別作為系統(tǒng)分辨能力的判斷依據.參照該判斷依據,針對CLSM點掃描式的特點,本文提出納米分辨率測試標準樣品(以下簡稱納米標樣)應具備以下特點: 多方向的周期性測量圖案、合理緊密的線寬梯級序列分布、明確的指示標記圖案、高精確度和高對比度等.

2 納米標樣

2.1 設計方案

目前,與納米標樣相關的成果包括: Stark團隊[18]利用聚焦離子束刻蝕技術,在摻有熒光分子的聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methyl methacrylate),PMMA)電子膠上刻出若干等寬 (100 nm)的納米線條和同心圓環(huán); Iketaki團隊[19]利用紫外納米壓印技術,在染色紫外光刻膠上制備出多組納米線條,包含從80 nm到160 nm的線寬; Huebner團隊[20]運用電子束曝光與刻蝕技術,在非晶硅上制備多組納米標記圖案,包括線條、棋盤和圓環(huán)三種圖形,可用于多個方向上的分辨率測試.然而,以上方法都沒有合理的線寬梯級序列,無法達到精確測試超分辨顯微系統(tǒng)性能的目的.

圖1所示是本工作提供的納米標樣設計方案,分為測量區(qū)域和指示標記兩個區(qū)域.其中,測量區(qū)域包括了29個測量圖案,它們按照空間頻率遞增的方式,螺旋排列于測量區(qū)域.每一個測量圖案都包含了5個部件,包括一維光柵 (X方向和Y方向)、二維光柵、同心圓環(huán)光柵和數(shù)碼標識.在測量區(qū)域周圍四個方向上分布了大小兩種直角三角形指示標記,它們指向測量區(qū)域,能夠明確地指出測量區(qū)域的位置.該設計方案具有測試功能齊全、測量精度高、測量范圍寬、圖案排列緊湊、線寬序列分布合理、指示標記巧妙等優(yōu)點,適用于點掃描式的超分辨顯微系統(tǒng),如矢量光場CLSM.

圖1 納米標樣設計示意圖 (a)納米標樣總覽圖; (b)測量區(qū)域示意圖; (c)指示標記示意圖,即(a)中紅框區(qū)域;(d)單個測量圖案示意圖,即(b)中紅框區(qū)域Fig.1.Designing of the nanoscale standard sample: (a)Overview of the standard sample; (b)measure area; (c)direction marks; (d)a single measure pattern.

另一方面,設計方案中不同的結構線寬大小相差高達25倍,這會給制備帶來困難.在制備時要同時考慮效率與精確程度,應采用不同工藝參數(shù)實現(xiàn)不同的結構.

2.1.1 測量區(qū)域

測量區(qū)域是一個大小為 150 μm × 150 μm 的區(qū)域,測量區(qū)域的設計參考了GB/T 6161-2008 ISO 2號解像力測試圖[17],并加以改進,使之功能更全面.如圖1(b)所示,測量區(qū)域一共包括29個測量圖案,其梯級序列參考了國家標準GB/T 321-2005所提供的R20系列優(yōu)先數(shù)[21],從1.0開始,以空間頻率遞增的方式呈螺旋排列.如圖1(d)所示,每個測量圖案包含的4組光柵(水平方向一維光柵、垂直方向一維光柵、二維光柵、同心圓環(huán)光柵)都是等間距分布,且結構寬度與間隔相等,可以用于多方向的分辨率測試,同時可以用于檢驗顯微系統(tǒng)的畸變情況.而數(shù)碼標識對應測量圖案中各組光柵每微米空間頻率大小的兩倍,單位是cycles/μm,恰好是各組光柵結構線寬(以μm為單位)的倒數(shù),因此通過辨認數(shù)碼標識就可以直接得出該測量圖案結構的線寬大小.

綜上,測量圖案包含多個方向上的周期性結構,功能齊全,且擁有合理的線寬序列和緊湊的排列方式,只需要在測試區(qū)內小范圍移動樣品就可以快速找到臨界測試位置.一次測試結果就可以得到不同方向和位置的分辨率數(shù)據,同時可以檢測畸變程度等其他性能指標,能夠有效全面地測試顯微鏡的性能,為矢量光場CLSM的性能測試和調試提供了一種更加嚴謹?shù)耐緩?

2.1.2 指示標記

在點掃描式的CLSM中,要在空白背景下尋找150 μm × 150 μm大小的測量區(qū)域是非常困難的,因此需要指示標記來幫助我們快速尋找測量區(qū)域的位置.

如圖1(c)所示,指示標記為分布在測量區(qū)域四個方向上的直角三角陣列,以其最小的銳角為方向指向測量區(qū)域中心.指示標記按照距離測量區(qū)域的遠近分為兩種尺寸,一級標記位于距測量區(qū)域500—1000 μm 的范圍,長直角邊長 2 μm,短直角邊長1 μm; 二級標記位于距測量區(qū)域10—500 μm的范圍,長直角邊長1 μm,短直角邊長0.5 μm.

當找到任意一個三角形標記時,通過觀察其指示方向和大小,即可直接得知測量區(qū)域的大致方位與距離,在測試中可快速定位到測量區(qū)域,提高實驗效率.此外,用文獻[10]中類似的方法,利用該標記的尖端也可以粗略測試顯微鏡的分辨率.

2.2 制備與檢測

首先制備了硅納米標樣,適用于反射式矢量光場CLSM.制備過程使用厚度為500 μm的單拋非晶硅片作為襯底,將比例為1∶4的氫倍半硅氧烷薄膜 (hydrogen silsesquioxane,HSQ,采用 DOW公司FOxTM16型號產品)與甲基異丁酮(methyl isobutyl ketone,MIBK)混合溶液以旋涂工藝覆蓋到襯底上,并在90 ℃熱板上烘5 min,得到200 nm厚的電子抗蝕層,用于電子束曝光.完成曝光后,在四甲基氫氧化銨(tetramethylammo-nium hydroxide)顯影液中浸泡90 s,純水中浸泡30 s,氮氣吹干,得到帶有標樣圖案的HSQ抗蝕層.

在納米加工中,線寬的準確性通常是最重要的考慮因素[22].在制備過程中,曝光劑量、顯影時間和束斑步長都會影響顯影后圖案的平面與截面的形狀,進而影響刻蝕后結構線寬的準確性,而對于不同線寬大小的結構,這種影響的顯著程度是不同的.在未經參數(shù)調整的情況下產出的樣品中,大線寬的結構(標識1—4.5)的誤差小于15 nm,相對誤差較小; 但是部分小線寬結構(標識5—25)的誤差可以達到25 nm左右,相對誤差最高達52.7%,標識20—25的測試圖案甚至出現(xiàn)圖案不完整或者粘連的情況.

為了克服大線寬跨度帶來的制備困難,盡可能保證線寬的精確性,需要根據已有實驗的結果,按組進行曝光劑量調整與線寬修正.在進行電子束曝光時,將圖案分為4組,采用不同的曝光劑量、不同大小的束斑步長與不同的寬度修正等參數(shù)進行曝光,經過近十次的工藝探索,篩選出的具體曝光參數(shù)如表1所列,其中指示標記對精確程度要求不高,使用大束流可以提高曝光效率.

表1 硅納米標樣曝光參數(shù)Table 1.Exposure parameters of the silicon nanostandard sample.

完成顯影后,使用電感耦合等離子體刻蝕技術,以溴化氫氣體作為刻蝕氣體,將HSQ抗蝕層的圖案轉移到硅片上,刻蝕深度200 nm.刻蝕后用10% 氫氟酸溶液浸泡樣品,去除殘留的HSQ抗蝕層,完成納米標樣的制備.

制備完成后使用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)檢驗納米標樣制備效果.圖2所示為硅納米標樣各區(qū)域的形貌細節(jié).

利用SEM的測量功能,對每一個測試圖案中各組光柵的各結構進行多次測量,取其平均值作為該測試圖案的線寬,并與設計線寬做比較,各測試圖案的誤差與相對誤差如圖3所示.

圖2表明,該樣品細節(jié)完整,圖案清晰,沒有出現(xiàn)結構殘缺或粘連的情況.圖3中誤差的分布情況表明各結構的誤差都比較小,大部分測試圖案的相對誤差都保持在 ± 10%范圍內,僅有2個測試圖案(數(shù)碼標識為16和25的測試圖案)超出該范圍.計算得到誤差平均值—5.93 nm,標準差為9.32 nm;同時也可以看出不同曝光參數(shù)使得不同組之間的誤差分布有明顯不同,第1組與第2組的誤差分布存在突變,但整體線寬更接近設計線寬.其中第1組(標識1—4.5)整體線寬偏小,誤差最大,但其線寬大于200 nm,相對誤差很小,可以滿足衍射極限內光學顯微鏡的分辨率測試要求; 第2組(標識5—18)經修正后,誤差得到縮小,絕對值小于12 nm;第3組(標識20—25)的誤差絕對值小于5 nm,十分接近設計線寬.這種精度已經可以滿足我們檢測超分辨顯微系統(tǒng)性能的要求.

圖2 硅納米標樣SEM結果展示 (a)測量圖案全貌;(b)(a)中紅框部分的細節(jié)展示; (c)指示標記Fig.2.SEM images of Si standard sample: (a)Overview of standard sample; (b)details of the red dash area in (a);(c)direction marks.

以上結果表明,以這種工藝制備得到的樣品,符合第1節(jié)提出的樣品要求,可以作為檢驗矢量光場CLSM性能的標準樣品.

圖3 硅納米標樣各測量圖案制備誤差分布,其中x軸采用對數(shù)坐標軸 (a)線寬誤差分布; (b)相對誤差分布Fig.3.Fabrication error distributions of the silicon nano standard sample,in which use logarithmic axis as x-axis:(a)Linewidth error distribution; (b)relative error distribution.

3 矢量光場CLSM光學測試

本次測試采用的顯微系統(tǒng)是本團隊自主搭建的矢量光場CLSM,其結構如圖4所示.該顯微鏡是在普通的共聚焦顯微鏡的光路中,加入了渦旋片與環(huán)形孔徑,得到經空間調制的徑向偏振光,激發(fā)樣品,使系統(tǒng)的點擴散函數(shù)受到約束,從而提高顯微鏡的分辨率[10].

測試采用波長為405 nm的線偏光作為矢量光場CLSM的光源,光線經過渦旋半波片轉換成徑向偏振光,經環(huán)形孔徑調制后稱為環(huán)形光場,通過油浸物鏡 (Olympus UPlanSApo 100 ×/1.40,介質油折射率n=1.5)聚焦到納米標樣上,反射光線再反向經過環(huán)形孔徑和渦旋片,轉換成線偏光,經透鏡聚焦通過直徑為15 μm的針孔將光信號傳入光譜儀中.移動納米平移臺,逐點將信號發(fā)送給計算機處理并輸出相應結果.

圖4 矢量光場CLSM光路示意圖Fig.4.Optical path of vector beams field CLSM.

在矢量光場CLSM的成像分辨率測量實驗中,所使用的硅納米標樣(未經線寬修正)所有的測試圖案的線寬都經SEM測量,與數(shù)碼標識一一對應,將光學測試圖像與SEM圖像對比即可得出分辨率數(shù)據.圖5展示了硅納米標樣部分測試圖案光學掃描結果及SEM掃描結果的對比,第一行是光學掃描輸出結果,x-y軸均為相對位置,信號強度單位為光子數(shù),第二行是相應的測試圖案電鏡掃描結果,用紅框標出了第一行的圖案對應的位置.其中5個測試圖案的結構線寬經SEM測量,分別是985,205,113,96和88 nm.初步分析表明,矢量光場CLSM的分辨率可以達到亞100 nm數(shù)量級.同時由于受到樣品光電物性的影響,矢量光場CLSM讀出信號的強弱分布與樣品的形貌有關,如圖5(a)中數(shù)碼標識“1”字,其結構連接處產生了強信號.

4 討 論

為了排除偽解像力缺陷的現(xiàn)象,當顯微鏡能分辨出某一組光柵(如一維光柵或者圓環(huán)光柵)全部的5個結構,才認為該顯微鏡能夠分辨該測試圖案[17].若只分辨出4個或者更少的結構,則認為無法分辨.

由于光與物質的相互作用,圖5的光學掃描結果部分結構之間的光場發(fā)生了相互干擾,降低了信號與背景對比度,也降低了信號的規(guī)律性,從而影響了直接用肉眼來判讀分辨率(特別是圖5(e)).但拋開其他指標,僅僅針對分辨率測試而言,可以通過繪制強度變化曲線,從曲線的斜率變化中找到結構對應的信號,并確定可被分辨的結構的數(shù)量.以圖5(d)中恰好能被分辨的最小測試圖案為例,如圖6所示.圖6(a)中白色虛線位置的信號強度變化可繪制為圖6(b)中的強度分布曲線.受相互作用現(xiàn)象影響,結構信號都是弱信號,而背景的強度波動顯著,會給判讀帶來干擾.從強度曲線上可以找到5處類似于“缺口”的弱信號(曲線上紅色方形標記)的位置,即為5處圓環(huán)結構,因此認為矢量光場CLSM能夠分辨該測試圖案.相應地,利用該方法,圖5(a)—(c)中的測試圖案都可以被完整分辨,對于圖5(e)乃至更小的測試圖案,則無法分辨.受限于篇幅,在此不一一展示.

圖5 硅納米標樣部分掃描結果與SEM結果對比 第一行,矢量光場CLSM掃描結果; 第二行,對應的SEM掃描結果,對應位置已用紅框標出Fig.5.Comparison between optical scanning images (first row)and SEM images (second row)of the Si standard sample.The corresponding positions are marked by red dash squares.

圖6 數(shù)據處理結果 (a)顯微系統(tǒng)分辨率臨界測量圖案;(b)是(a)中白色虛線位置信號強度分布曲線,根據曲線斜率的變化,從圓心出發(fā)可以找出5個弱信號(紅色方形),其坐標的間隔也符合SEM掃描結果,因此認為可以分辨Fig.6.Data analysis result: (a)The critical resolution measurement image obtained by microscopy; (b)amplitude distribution of white dash line,according to the slope variation,5 weak signal (red square marks)can be found.

從以上結果中得到的結論是: 該納米標樣可用于矢量光場CLSM的分辨率測試,同時測得采用405 nm光源的矢量光場CLSM可以在介質油環(huán)境(n=1.5)中達到96 nm的分辨率.在測試過程中也暴露了顯微系統(tǒng)的若干問題,由于嚴格對稱的矢量光場對于系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求很高,在進行長時間的測試后,得到的結果將出現(xiàn)變形,無法得到精細掃描的大范圍結果,需要進一步加強顯微系統(tǒng)的穩(wěn)定性.

理論研究結果表明[10,15],在矢量光場CLSM中使用合適的環(huán)形孔徑和針孔、約束系統(tǒng)點擴散函數(shù),有望達到小于1/5λ的分辨率.以405 nm波長為光源,矢量光場CLSM有望達到81 nm的分辨率,比532 nm光源理論上的分辨率(106 nm)更進一步.不過目前矢量光場CLSM的分辨率離理論值還有一些差距,需要在后續(xù)調試中進一步提高分辨率.

另一方面,圖5的光學掃描結果表明,納米尺度光學的成像會受到光場在納米結構中的光子態(tài)密度、光場模式分布和樣品材料物性的影響,這種影響隨著線寬的減小而變得更加顯著,導致對比度下降,使得獲取到的圖像逐漸偏離掃描電鏡的物理形貌測量結果,阻礙分辨率的精確測量.

為此,在石英襯底上制備金屬結構納米標樣(簡稱石英-金屬納米標樣)被進一步提出.該樣品(共兩層: 10 nm鈦和100 nm金,其中鈦層是為了增加結構的黏附性)的分辨率測試圖案,適用于透射式與反射式的CLSM.石英-金屬納米標樣的襯底與結構的材料物性相差很大,反射率差達40%以上(405 nm),有望避開上述影響.首先在厚度為1 mm的石英玻璃上旋涂500 nm PMMA電子膠,再濺射50 nm厚的鋁層用于增強樣品導電性,經過電子束曝光后,使用5%磷酸溶液50 ℃水浴去除鋁層,依次使用MIBK、異丙醇和純水浸泡顯影,得到帶測量圖案的PMMA層.采用電子束蒸鍍技術在樣品上蒸鍍10 nm鈦和100 nm金,最后用丙酮溶液浸泡樣品,去除PMMA殘膠,得到石英-金屬納米標樣.

圖7所示為兩種不同材料樣品的光學掃描圖像的對比,選用掃描的對象是納米等邊三角形,材質分別是石英襯底金屬材質(邊長4 μm)和硅材質(邊長0.8 μm),納米三角所處位置在圖中用紅色虛線標出,x-y坐標軸均表示相對位置,信號強度單位為光子數(shù).

反射光信號對比度C定義為

其中N為光子數(shù).

根據(1)式,石英/金屬納米三角的信號對比度為0.786,硅納米三角的信號對比度為0.099.計算結果表明,石英/金屬納米樣品比硅樣品擁有更高的反射率差和對比度,對于分辨率的精確測量將提供更大幫助.另一方面也可以看到,圖7(b)中硅三角島的光學成像結果也在一定程度上偏離了物理形貌,上述樣品的光電物性對光學顯微結果的作用機理尚待進一步深入探討.

圖7 兩種不同材質納米等邊三角的光學掃描結果對比(a)石英基底金屬納米等邊三角; (b)硅納米等邊三角Fig.7.Comparison between optical scanning images of two nano-triangles made from different materials: (a)A quartz substrate metal nano equilateral triangle; (b)a silicon nano equilateral triangle.

不過石英-金屬納米標樣制備方法更復雜,制備精度受限于蒸鍍金屬材料(鈦和金)的顆粒大小,精度差于硅納米標樣; 制備過程中線寬小于100 nm的結構容易脫落,導致測試圖案不完整.這些問題對制備高質量的石英/金屬納米標樣帶來很大挑戰(zhàn),因此該制備方案還需進一步探索,完善制備工藝,以制作出高質量的石英-金屬納米標樣.

5 結 論

綜上所述,在前人工作的基礎上,我們總結出適用于測量矢量光場共聚焦激光掃描顯微鏡分辨率的納米標準樣品的設計要求,并提供了設計方案和制備工藝,該納米標樣提供40—1000 nm范圍內分辨率的精確測量,具有多種類測試圖案、緊密的線寬梯級序列分布、較高的精度和巧妙的指示標記,能夠在快速準確地檢測顯微系統(tǒng)的最佳分辨率.首先利用電子束曝光與電感耦合等離子體刻蝕技術,在非晶硅片上實現(xiàn)納米標樣的制備,在此基礎上不斷探索工藝參數(shù),將線寬的誤差控制在合理范圍內.在光學掃描中檢驗硅納米標樣的應用效果,使用405 nm光源的矢量光共聚焦激光掃描顯微鏡,精確檢測到顯微系統(tǒng)的分辨率達到96 nm(介質油n=1.5),同時也暴露出顯微鏡穩(wěn)定性的不足,為顯微鏡進一步的調試與改進工作提供了指導.測試中發(fā)現(xiàn),納米尺度的光學成像效果除了受到樣品形貌的影響外,還受到到樣品的光電物性的影響,其相互作用機理尚待進一步深入研究.作為補充,本工作進一步制備了石英基底金屬納米樣品,納米標樣光學成像結果的低對比度問題得到改善,對于分辨率的精確測量將提供更大幫助.這一設計方案,為矢量光場CLSM的亞100 nm尺度的分辨率提供了一種更嚴謹?shù)臏y試途徑,也為顯微系統(tǒng)調試改進提供原理性指導.

后續(xù)的工作將進一步探索透明基底金屬納米標樣更精確的制備工藝,做出更精確與更高對比度的納米標準樣品,為遠場矢量光共聚焦顯微鏡探尋更小尺度的光學成像過程提供更多支持; 另一方面,也將對納米尺度光學成像過程中,樣品的光電物性對于形貌表征的影響機制進行深入研究.

感謝中山大學光電材料與技術國家重點實驗室李俊韜教授與周麗丹工程師在樣品制備過程中提供的思路與幫助.