黃 萃，伍思華，李 鈺，鄧賢才，鄔向東

烏雞源多殺性巴氏桿菌殺禽亞種16S rDNA鑒定及藥敏分析

黃 萃，伍思華，李 鈺，鄧賢才，鄔向東*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

2018年底某烏雞場突然暴發(fā)一起急性死亡疫情，細菌分離純化得到菌株JX-Pm01。該分離菌株經(jīng)染色鏡檢、16S rDNA基因片段PCR擴增與測序分析，結(jié)果表明分離菌株JX-Pm01與多殺性巴氏桿菌同源性接近100%，其中與殺禽亞種同源性最高，達99.3%，初步判定分離菌株為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種，該次疫情為禽霍亂。為防治該病提供參考，篩選敏感藥物進行防治，筆者對分離菌株JX-Pm01進行了藥物敏感試驗，結(jié)果表明該分離菌株對氨芐西林、丁胺卡那、多西環(huán)素和恩諾沙星敏感，對頭孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、林可霉素和諾氟沙星耐藥。

烏雞；16S rDNA鑒定；多殺性巴氏桿菌；多殺性巴氏桿菌殺禽亞種；藥敏分析

多殺性巴氏桿菌（）是引起畜禽巴氏桿菌病的病原菌，是一種革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，無鞭毛、不形成芽胞、不運動，可感染家禽、豬和牛等多種動物以及人，引起禽霍亂、豬肺疫和牛出血性敗血癥等多種傳染病[1-2]。多殺性巴氏桿菌病廣泛流行于世界各地，目前在我國多種家畜、家禽和野生動物中均有多殺性巴氏桿菌病發(fā)生，且發(fā)病率和死亡率均較高，給畜禽生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失，是危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的重要細菌傳染病之一[3-4]。因此，畜禽多殺性巴氏桿菌病的診斷和防治至關(guān)重要。

2018年11月南昌某雞場雞群突然發(fā)病，且短時間內(nèi)出現(xiàn)大批死亡，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院從發(fā)病雞的肝臟中分離到一株細菌，在本實驗室經(jīng)過微生物學(xué)診斷和16S rDNA基因鑒定，判定其為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種；同時選取14種抗生素進行了藥敏試驗，結(jié)果表明分離菌對氨芐西林、丁胺卡那、多西環(huán)素和恩諾沙星敏感，為該雞場的病情防治提供了及時有效的幫助。

1 試驗材料

1.1 病料來源

江西省南昌市某雞場送檢發(fā)病烏雞的肝臟等病料。

1.2 主要試劑和儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基，由實驗室自制；小牛血清，購自杭州江濱生物技術(shù)有限公司；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，購自北京全式金生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；飽和酚、溴化乙錠（EB）、SDS、Tris堿等，購自Solarbio公司；瓊脂糖購自Sigma公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器

SW-CJ型凈化工作臺，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸氣滅菌器、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5415R型冷凍臺式高速離心機，購自Eppendorf公司；K960型PCR儀，購自杭州晶格儀器有限公司。

1.4 引物設(shè)計

分離株的16S rRNA基因序列的擴增采用細菌16S rRNA通用引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：16S(F)5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16S(R)5'-GGTTACCTTG TTACGACTT-3'。

2 試驗方法

2.1 細菌分離

無菌取發(fā)病雞肝臟，分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后進行觀察，挑取可疑單個菌落進行純化培養(yǎng)。

2.2 染色鏡檢

勾取純化培養(yǎng)的單個菌落進行革蘭氏染色，油鏡鏡檢，觀察記錄其形態(tài)特征。

2.3 細菌16S rDNA鑒定

2.3.1 細菌DNA提取 取一支1.5 mL EP管，加入100 μL雙蒸水，勾取2接種環(huán)純化培養(yǎng)的單個菌落，混勻，煮沸10~15 min；12 000 r/min離心7 min，取上清，作為細菌DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 細菌16S rDNA的PCR擴增 PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中含16S (F)和16S (R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL以及ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，30 min后在紫外燈下觀察結(jié)果，并拍照記錄。

2.3.3 16S rDNA測序與序列分析 用膠回收試劑盒回收目的片段，將純化回收的目的片段送至上海華大基因生物科技有限公司雙向測通測序。運用NCBI基因庫中的BLAST對獲得的序列進行同源性檢索，與細菌16S rRNA基因序列進行對比，若同源性百分比≥99%，可以定義到種的水平；若同源性在97%~98.9%，可以定義到屬的水平；若＜97%，則定義為科。選取與分離菌16S rDNA基因序列同源性高的細菌用DNAStar進行核苷酸同源性比對分析。

2.4 藥敏實驗

采用藥敏紙片擴散法，取100 μL小牛血清涂布于TSA培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫箱放置5 min，干燥后將藥敏紙片貼于TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＜10 mm為耐藥；抑菌圈直徑在10~15 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＞15 mm為高敏。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌分離結(jié)果

分離菌在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、邊緣規(guī)則、表面光滑、乳白色的露滴狀小菌落，無溶血現(xiàn)象（圖1）；在普通瓊脂培養(yǎng)基上幾乎不生長。

3.2 染色鏡檢

分離菌經(jīng)革蘭氏染色后進行鏡檢，結(jié)果如圖2。可見分離株為革蘭氏陰性的短桿菌，菌體兩端鈍圓，呈單個散在分布或成雙存在?？梢蔀槎鄽⑿园褪蠗U菌，并命名為JX-Pm01。

圖1 細菌分離結(jié)果

圖2 細菌染色結(jié)果（革蘭氏染色，10×100）

3.3 細菌16S rDNA鑒定

3.3.1 16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果 如圖3所示，可以看到1條清晰的條帶，且長度約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符。

1：分離株16S rDNA擴增結(jié)果；M：100 bp Marker

3.3.2 16S rDNA基因測序與序列分析 分離株JX-Pm01的基因片段長度為1 443 bp，所得序列與NCBI基因庫BLAST中多殺性巴氏桿菌16S rDNA基因序列同源性達100%，初步判定該分離菌株為多殺性巴氏桿菌。選取BLAST同源性檢索中與分離菌同源性較高的多殺性巴氏桿菌殺禽亞種（subsp.）、多殺性巴氏桿菌敗血亞種（subsp.）、咬傷巴氏桿菌（）、犬巴氏桿菌（）、咽巴氏桿菌（）、口巴氏桿菌（）、買氏巴氏桿菌（）、產(chǎn)氣巴氏桿菌（）、豚放線桿菌（）、流感嗜血桿菌（）、副豬嗜血桿菌（）、多源曼氏桿菌（）、溶血性曼氏桿菌（）與分離菌JX-Pm01的16S rDNA基因序列進行同源性比對分析，結(jié)果如圖4。

結(jié)果表明JX-Pm01與巴氏桿菌核苷酸相似性達91.3%~99.3%，與多殺性巴氏桿菌同源性達99.1%，其中多殺性巴氏桿菌殺禽亞種與JX-Pm01同源性最高，達99.3%，進一步表明分離株為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種。而與同科的豚放線桿菌、流感嗜血桿菌、副豬嗜血桿菌、多源曼氏桿菌、溶血性曼氏桿菌核苷酸同源性高達91.4%~97.3%，說明巴氏桿菌各種屬之間的差異性較小，尤其與咽巴氏桿菌的同源性達97.3%。

圖4 分離菌16S rDNA基因序列同源性比對分析

3.4 藥敏實驗

分離株JX-Pm01對14種藥物敏感性測定結(jié)果如表1，JX-Pm01對氨芐西林、丁胺卡那、多西環(huán)素和恩諾沙星高度敏感，對頭孢哌酮、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明中度敏感，對頭孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、林可霉素和諾氟沙星耐藥。

表1 分離菌株JX-Pm01對14種藥物的敏感性

S表示高度敏感；I表示中度敏感；R表示耐藥；—表示未檢測到抑菌圈

4 小結(jié)與討論

試驗從患病雞肝臟分離到一株細菌JX-Pm01，經(jīng)染色鏡檢結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢，可疑為多殺性巴氏桿菌。經(jīng)16S rDNA基因片段PCR擴增與測序分析，基本判定其為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種。

多殺性巴氏桿菌引起的禽霍亂被OIE列為B類疫病[5]，其發(fā)病率和死亡率均較高。及時準(zhǔn)確診斷對于該病的防治，降低養(yǎng)殖戶的損失有重要意義。選用抗菌藥物仍是防治霍亂的主要措施，然而耐藥性的產(chǎn)生，甚至是多藥耐藥基因[6]，使本病的藥物治療效果不佳。本試驗通過藥敏試驗，結(jié)果表明JX-Pm01對氨芐西林、丁胺卡那、多西環(huán)素和恩諾沙星敏感，對頭孢哌酮、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明中度敏感，而對頭孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考、紅霉素、林可霉素和諾氟沙星耐藥。這與邊彥超等[7]和王彩麗等[8]報道的多殺性巴氏桿菌對藥物的敏感與本試驗分離菌的耐藥性存在不少差異。因此當(dāng)養(yǎng)殖場發(fā)生多殺性巴氏桿菌病時，需要根據(jù)藥敏試驗篩選藥物進行科學(xué)用藥，減少病原菌對抗生素耐藥性的產(chǎn)生，使其獲得良好的治療效果。

[1] Wilkie I W, Harper M, Boyce J D, et al. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 2012(361):1-22.

[2] 高家登, 扎西達瓦, 曲久, 等. 多殺性巴氏桿菌病的研究[J]. 中國畜禽種業(yè), 2017(9):35-37.

[3] Harper M, John M, Edmunds M, et al. Protective efficacy afforded by livevaccines in chickens is independent of lipopolysaccharide outer core structure[J]. Vaccine, 2016,34(14):1696-1703.

[4] 彭欠欠, 蘇佳文, 孫王楊吉, 等. 一株多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與耐藥性研究[J]. 中國家禽, 2017(10):51-53.

[5] 王開文. 一例雞巴氏桿菌病的診治[J]. 湖北畜牧獸醫(yī), 2016,37(5): 33-34.

[6] Kumar P, Singh V P, Agrawal R K, et al. Identification ofisolates of ruminant origin using polymerase chain reaction and their antibiogram study[J]. Tropical Animal Health and Production, 2009,41(4):573-578.

[7] 邊彥超, 劉小蘭, 康紹珠, 等. 雞巴氏桿菌的分離鑒定及體外抑制實驗[J]. 江西畜牧獸醫(yī)雜志, 2018(1):20-23.

[8] 王彩麗, 榮俊, 王化俊, 等. 雞多殺性巴氏桿菌的鑒定和藥物敏感試驗[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 49(5):1162-1165.

16S rDNA Identification and Drug Sensitivity Analysis ofsubsp.

HUANG Cui, WU Si-hua, LI Yu, DENG Xian-cai, WU Xiang-dong*

(School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

At the end of 2018, a black chicken farm violently developed an acute death epidemic, and the strain was isolated and purified to obtain strain JX-Pm01. The isolated strain was stained by microscopy, 16S rDNA gene fragment PCR amplification and sequencing analysis. The results showed that the isolated JX-Pm01 was nearly 100% homologous to, and the highest homology with thesubsp., was up to 99.3%, which initially determined that the strain wassubsp., and the epidemic was avian cholera. In order to provide a reference for the prevention and treatment of this disease, screening sensitive drugs for its prevention and treatment, a drug sensitivity test on the isolated strain JX-Pm01 was conducted. The results showed that the isolated strain was sensitive to ampicillin, amikacin, doxycycline and enrofloxacin, but was resistant to ceftriaxone, kanamycin, florfenicol, erythromycin, lincomycin and norfloxacin.

black chicken; 16S rDNA identification;;subsp.; drug sensitivity analysis

http://xuebao.jxau.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-3704.2019.03.52

S831；S852.61

A

2095-3704（2019）03-0243-05

2019-08-30

黃萃（1995—），女，碩士生，主要從事動物病原及免疫學(xué)研究，1415365418@qq.com；

鄔向東，dxywxd2006 @126.com。

黃萃, 伍思華, 李鈺, 等. 烏雞源多殺性巴氏桿菌殺禽亞種16S rDNA鑒定及藥敏分析[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2019, 42(3): 243-247.