東莎莎，程素盼，馬天宇，劉偉，張渝潔，王曉，劉代成，趙恒強*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東 濟南 250014； 3.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276005; 4.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014)

丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，丹參中丹酚酸類成分有明顯的抑制血小板聚集、抗凝血及降低血脂、抗動脈粥樣硬化的作用，能縮小心肌梗死的范圍，減輕病情，具有較大的臨床藥用價值，廣泛用于臨床各種心血管疾病的治療[4-5]。2015版《中國藥典》將丹酚酸類的丹酚酸B作為質控指標[1]。中藥具有多成分、多靶點的特點，單一的指標成分不能全面反映中藥的質量。因此，丹參中丹酚酸類、多成分的同時分析測定是提升丹參藥材質量評價標準的必然要求。

目前，丹參中丹酚酸類成分主要采用超聲和水浴回流法提取[1,6-7]，用反相色譜法進行分析。超聲提取法在提取過程中由于其熱效應會造成提取溶劑溫度升高，水浴回流提取本身采用溶劑加熱、蒸發(fā)、冷凝回流方式提取，而丹參酚酸類成分本身是熱不穩(wěn)定成分，兩種提取方式不可避免會造成目標物一定程度的分解，影響最終測定結果準確性。另外，丹參中丹酚酸類成分在反相色譜柱上保留較差，為提高保留效果，一般采用高比例水相進行洗脫，然而高比例水相會影響色譜柱使用壽命，同時與質譜的兼容性較差。因此，發(fā)展探究丹參中丹酚酸類、多成分的準確、高效提取和對色譜、質譜兼容性好的分析方法具有重要意義。

超高壓(ultrahigh pressure extraction, UPE)提取技術是近年來新發(fā)展的一種高效提取技術，利用100 MPa以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液，保壓一段時間后卸壓，因其內外壓差驟變使細胞破裂，有效成分釋放出來，從而達到提取的目的。該方法與超聲波輔助提取法和水浴回流提取法相比有提取率高、提取時間短、能耗低、純度高[8-10]等優(yōu)點，并且避免了因熱效應引起的有效成分結構變化、損失以及生理活性的降低。目前，該技術在天然化學成分提取中的應用越來越廣泛，已成功提取了黃酮、皂苷、生物堿、茶多酚等多種中藥化學成分[11]。親水色譜(HILIC)是一種新型色譜分離技術，其采用強極性材料作為固定相，對極性和水溶性成分保留較好；以高比例的乙腈作為有機相，與質譜兼容性較好；與電噴霧飛行時間質譜(ESI-TOF/MS)聯(lián)用可以實現(xiàn)對極性成分的良好分離和鑒別。目前，該技術在天然產物極性成分分析中表現(xiàn)出良好的應用前景[12-16]。

本研究建立了UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS提取和分析測定丹參中丹酚酸類成分的方法，并用于山東產區(qū)丹參藥材中丹酚酸類成分的測定，研究結果將為丹參中丹酚酸類多成分的高效提取和分析測定提供技術支持。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配有二極管陣列(DAD)檢測器，四元泵，柱溫箱，自動進樣器等；Agilent 6520 Q-TOF液質聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；HPP·L3-600型超高壓生物提取設備(天津市華泰森淼有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；THZ-8恒溫水浴鍋(中國浙江嘉興電熱儀器廠)。

XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm，美國Waters)；Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,德國Merck) ；XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm，美國Waters)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)；甲酸、乙酸銨、甲酸銨(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；其余試劑均為分析純，水為自制Milli-Q超純水。

1.2 樣品的收集與處理

本研究所采用的丹參樣品均采自濟南各大藥店以及不同種植基地，采集時間為2011年至2012年，采集12個不同批次的樣品，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為正品丹參SalviamiltiorrhizaeBge.，所采集到的樣品詳細信息見表1。丹參樣品置于烘箱中55 ℃鼓風干燥4 h。干燥后粉碎，過40目篩子，混合均勻，制備成丹參干粉樣品，密閉、避光、干燥、常溫貯藏。

表1 丹參藥材來源

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 超高壓提取法

a 提取溶劑 b 料液比 c 提取時間

2.1.2 超聲波輔助提取法

2.1.3 水浴回流提取法

不同提取方式下的色譜圖見圖2。

圖2 不同提取方式下的色譜圖Fig.2 Chromatograms of samples prepared using different extraction methods

2.2 標準溶液的配制

分別精密稱取丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對照品各1.0 mg，置于1 mL量瓶中，用去離子水定容至刻度線，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品儲備溶液，保存?zhèn)溆谩＞芪「鲗φ掌穬湟哼m量于1 mL容量瓶中，加去離子水定容至刻度，配成含丹酚酸B 50 μg/mL，含其余標準品40 μg/mL的標準混合對照品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流動相A：0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨、30%乙腈、10%正丁醇的水溶液，流動相B：乙腈(含0.8%甲酸)，流速為0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，進樣量20 μL，洗脫程序為T：0-5-12-17-23-27-35-40-43-50-55-57-60-62 min，B%：94%-94%-92%-90%-89%-88%-87%-86%- 86%-85%-60%-50%-45%-20%。優(yōu)化后的色譜圖見圖3。

圖3 丹參HILIC-DAD(280 nm)色譜圖Fig.3 HILIC-DAD (280 nm) chromatogram of Danshen

2.4 質譜條件

ESI-MS工作條件如下：負離子電離模式，霧化氣壓力45 psi，干燥氣(N2)流速10.0 L/min，干燥氣體溫度340 ℃，毛細管電壓4300 V，裂解電壓100 V，錐孔電壓60 V，全掃描(Scan)質荷比(m/z)為50～1000。樣品的總離子流圖見圖4，質譜鑒別結果見表2。

圖4 丹參HILIC-ESI-TOF/MS 總離子流Fig.4 TIC chromatogram of HILIC-ESI-TOF/MS of Danshen

表2 丹參提取物中7個化合物的HILIC-ESI-TOF/MS測定結果

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線及檢測限

按2.3節(jié)色譜條件進樣分析，測定各不同濃度的混合標準液中各化合物的峰面積，以各化合物濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并求得回歸方程。將標準溶液稀釋至低濃度進樣，以3倍信噪比計算各丹酚酸類成分的檢測限，以10倍信噪比計算定量限，結果見表3。

表3 7種酚酸HILIC分析回歸方程、線性范圍等結果

2.5.2 精密度

按2.3節(jié)色譜條件，對同一供試品溶液重復進樣6次測定，分別測得7個色譜峰的峰面積和保留時間，分別計算其相對標準偏差。7個色譜峰峰面積和保留時間相對標準偏差為0.26%～3.79%和0.31%～2.25%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性

精密稱取同一丹參樣品6份，按2.1供試品溶液制備方法進行處理，按照2.3節(jié)色譜工作條件進樣分析，測得7個色譜峰的峰面積和保留時間，并計算其相對標準偏差，7個色譜峰峰面積和保留時間的相對標準偏差分別為1.59%～4.43% 和1.31%～2.21%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性

將供試品溶液按照2.3節(jié)色譜工作條件，分別在0、1、3、6、12、24 h進樣測定，結果顯示，7個色譜峰峰面積和保留時間的相對標準偏差分別為1.48%～3.25%和0.72%～2.48%，說明供試品溶液在24 h內化學性質穩(wěn)定。

2.5.5 加標回收率

精密稱取已知各目標化合物含量的丹參樣品0.50 g，分別準確加入丹酚酸A、迷迭香酸、原兒茶醛、原兒茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B對照品適量，按照供試品溶液制備方法處理6 份，按上述色譜條件進樣分析，測定各目標化合物峰面積，計算平均加樣回收率(n= 6)分別為92.1%、95.7%、98.7%、102.7%、99.2%、95.8%、94.7%，相對標準偏差分別為3.43%、2.79%、4.17%、3.36%、3.18%、2.53%及3.57%。

2.6 樣品測定

采用2.1節(jié)供試品溶液制備方法制備樣品溶液，采用2.3節(jié)色譜條件分別進樣分析，獲得12批丹參樣品中7種丹酚酸類化合物色譜峰面積，將測得結果帶入表3的線性回歸方程，計算丹參樣品中各丹酚酸類化合物的含量(表4)。

表4 丹參中7種丹酚酸類化合物含量測定結果(n=3)

續(xù)表4

從表4 可以看出，12批山東產區(qū)丹參樣品中7種丹酚酸類成分含量以丹酚酸B含量最高，其平均值達到(38.725±5.464)mg/g；原兒茶醛的含量最低，其平均值達到(0.124±0.011)mg/g；7種丹酚酸類成分總含量為(45.714±5.537)mg/g。7種丹酚酸類成分含量由大到小依次為丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸、丹酚酸A、熊果酸、原兒茶醛。

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

本研究采用單因素試驗對超高壓提取條件進行了優(yōu)化?？疾炝瞬煌崛∪軇?水、20%甲醇、40%甲醇)對丹參水提物的提取效果(圖1a)，結果表明，用20%甲醇作提取溶劑時，丹參水提取物中4個代表性色譜峰(峰1、2、3、7)的相對峰面積(以水提物中4個代表色譜峰的相對峰面積作為1)整體較高，且色譜峰較多、各峰分離度好、基線平穩(wěn)，因此選擇20%甲醇作為丹參中丹酚酸類成分的提取溶劑。

在優(yōu)化的超高壓提取條件下，進一步對超高壓提取法、超聲波輔助提取法和水浴回流提取法進行了比較，如圖2所示。結果表明，采用超高壓提取法，丹參中丹酚酸類成分提取率明顯優(yōu)于超聲波輔助提取法和水浴回流提取法。

3.2 色譜條件優(yōu)化

不同的親水柱材料對親水性化合物分離效果存在明顯差別。本研究對1.1節(jié)中所列的3 根不同類型的色譜柱(XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm，美國Waters)、Merck SeQuant ZIC-HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，德國Merck)、XBridge HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美國Waters)進行了比較，結果表明，使用Waters XBridge Amide色譜柱獲得的丹參甲醇水提取物各色譜峰分離度高、分布均勻、峰對稱性較好。因此，選擇Waters XBridge Amide柱用于丹參甲醇水提取物的分析。

水和乙腈常被選作親水色譜的流動相，丹參中丹酚酸類成分復雜、數(shù)量較多，本研究采用乙腈-水作為流動相、采用梯度洗脫法用于其分離研究。由于酚酸類成分含有羧基，容易與色譜柱填料發(fā)生作用造成拖尾現(xiàn)象，加入一定量的有機弱酸會明顯抑制羧酸的電離，避免拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。另外，流動相中加入一定量的揮發(fā)性鹽，有助于改善色譜峰峰型，同時避免或減少對質譜離子化的影響。考察了水相和有機相中分別加入不同含量甲酸揮發(fā)性鹽的影響，結果表明，當選擇H2O(0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸銨)+乙腈(0.8%甲酸)作流動相時，各色譜峰分離良好，峰型尖銳。

由于乙腈-水體系對親水色譜柱上各丹酚酸類化合物洗脫能力較強，造成分離效果差?？疾炝怂嘀刑砑硬煌壤译妗⒄〈嫉姆蛛x效果，結果表明，采用0.8%甲酸+20 mmol/L甲酸銨+30%乙腈+10%正丁醇作為流動相A時，丹參水提物中各化合物具有較好的保留和分離效果。