董小林 錢雪橋 劉家壽 陳家林 王正凱 樊 華 姜瑞麗 周易勇

(1. 廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心, 農(nóng)業(yè)部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室, 海大中央研究院, 廣州 511400;2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國最重要的一種草食性淡水養(yǎng)殖品種, 約占全國所有淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20%以上[1]。雖然有關(guān)草魚營養(yǎng)需求的研究在20世紀70年代就開始了[2], 但是其營養(yǎng)需求的研究大多集中在仔稚魚和幼魚階段[1—5]。草魚的生長周期較長, 其上市規(guī)格在不同地區(qū)有較大差異,如華南、西南等地, 草魚體重達到750 g/尾即可上市, 而多數(shù)地區(qū)草魚體重需達到將近1500 g/尾再上市。為了給草魚商品飼料提供多種配方策略, 非常有必要開展中大規(guī)格草魚營養(yǎng)需求的研究。

飼料蛋白是影響魚類生長性能的最重要因素,也是商業(yè)飼料成本控制的最主要因子。如果蛋白水平不足, 氨基酸攝入量不能滿足機體蛋白合成的需要; 但是蛋白含量過高, 會產(chǎn)生大量的氨氮代謝廢物加重魚體的代謝負擔(dān)[6]。因此, 為了使飼料蛋白盡量用于機體的組織合成而非能量供應(yīng), 非常有必要研究魚類對能量源(脂肪和碳水化合物)的利用情況以及其與蛋白利用的關(guān)系。草魚是典型的草食物性魚類, 其消化生理特點決定了其對碳化物的利用能力優(yōu)于雜食性和肉食性魚類,一系列的研究也都證實, 草食性的草魚對碳水化合物的利用能力明顯優(yōu)于脂肪[4,7,8]。因此研究碳水化合物與蛋白的相互作用關(guān)系是解決草魚配方策略的重要途徑。

大量的文獻報道, 在脂肪水平固定的前提下研究蛋白與碳水化合物的關(guān)系主要有2種方式, 其一是隨著蛋白水平的提高逐漸降低碳水化合物水平,也就是在等能情況下蛋白需求的研究[2,3,9]; 其二是通過“蛋白×能量”的雙因子實驗設(shè)計[10,11], 即在幾個不同總能或可消化能水平下設(shè)置不同的蛋白水平, 這種方式其實是方式一的一種疊加設(shè)計。因此上述實驗設(shè)計都是為了維持一個設(shè)定的能量水平而同時反向調(diào)整蛋白和碳水化合物濃度(即高蛋白對應(yīng)低淀粉, 低蛋白對應(yīng)高淀粉)。在等能條件下研究蛋白與碳水化合物的關(guān)系是魚類營養(yǎng)需求研究的重要基本理論, 也便于從生物能量學(xué)的角度進行科學(xué)的對比分析。但是對早期的研究分析發(fā)現(xiàn),等能設(shè)計似乎不利用對機體更高生長性能的探求。為此, 本文嘗試不用一個特定的總能水平去限制淀粉的用量, 通過這種開放式設(shè)計探討草魚獲得更高生長性能對應(yīng)的營養(yǎng)素需求水平以及蛋白與碳水化合物的相互作用關(guān)系。

本研究分別以中規(guī)格(460 g)草魚和大規(guī)格(1970 g)草魚為研究對象, 研究飼料蛋白和碳水化合物水平對2個生長階段草魚生長和飼料利用的影響, 以期為中大規(guī)格的草魚商品飼料配方提供多種技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計與實驗飼料

本研究采用2×4雙因子設(shè)計, 在2個淀粉添加水平下分別設(shè)置4個蛋白梯度。實驗一： 初重460 g/尾的中規(guī)格草魚的2個淀粉梯度為25%和35%, 4個蛋白梯度為22%、24%、26%和28%; 實驗二： 初重1970 g/尾的大規(guī)格草魚的2個淀粉梯度為30%和40%, 4個蛋白梯度為18%、20%、22%和24%。選用魚粉和豆粕為蛋白源, 大豆油為主要脂肪源, 小麥淀粉為主要糖源。實驗一的配方如表 1所示, 實驗二的配方如表 2所示。所有原料均采用市售標準原料, 外源油脂先用適量粉料混合后過30目網(wǎng)篩,以保證油脂預(yù)混合均勻。然后使用正昌250型制粒機進行配料生產(chǎn), 調(diào)制溫度80—90℃, 室溫冷卻后制成粒徑3.0 mm, 長度0.5 cm的實驗料, 然后用帶塑料內(nèi)膜的包裝袋密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗魚與養(yǎng)殖管理

實驗于廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心的海鷗島養(yǎng)殖基地進行。在正式實驗前,2種規(guī)格的草魚均置于基地池塘大網(wǎng)箱中暫養(yǎng), 用商品飼料常規(guī)飽食投喂。暫養(yǎng)1個月后, 對實驗魚饑餓24h, 挑選體格健壯、規(guī)格一致的草魚隨機分組, 中規(guī)格草魚[初重(460±1.7) g/尾]每個網(wǎng)箱50尾,大規(guī)格草魚[初重(1960±4.5) g/尾]每個網(wǎng)箱20尾。網(wǎng)箱規(guī)格為2 m×2 m×2 m, 每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。在實驗期間采用自動投餌儀于每天7：00、12：00、17：00投喂3次, 采取等量投喂策略, 投喂率約為體重的1.6%—2.0%, 保證每個網(wǎng)箱均沒有剩料。實驗期間每周測量池塘的水質(zhì)情況, 氨氮0.2—0.6 mg/L, 溶氧大于4 mg O2/L, pH 6.7—7.0。實驗期間的水溫為26—33℃。

表 1 中規(guī)格(460 g)草魚實驗料配方及營養(yǎng)組分(%以風(fēng)干樣為基礎(chǔ))Tab. 1 Formulation and nutrient contents of experimental diets of medium-size (460 g) grass carp (% air-dry basis)

1.3 實驗取樣及樣品分析

養(yǎng)殖56d后, 停喂1d, 于次日7：00對各網(wǎng)箱的實驗魚進行集體稱重, 并清點終末實驗魚尾數(shù)。然后從每個網(wǎng)箱挑選2尾實驗魚, 用剪刀從左側(cè)打開腹腔, 從距離草魚肝臟大葉邊緣 1 cm處采集約1 cm×1 cm大小的肝臟組織, 立即置于4%甲醛溶液中固定, 然后帶回實驗室按照常規(guī)組織切片法進行脫水、石蠟包埋、切片和HE染色(蘇木精-伊紅), 在顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)并拍照。

實驗飼料營養(yǎng)組分的測定采用AOAC(1995)的方法： 水分含量在105℃烘箱中烘至恒重測定。粗蛋白含量采用凱氏定氮法(Kjeltec 2300 Analyzer,Foss Tecator, Sweden)測定樣品含氮量, 然后乘以6.25得粗蛋白含量。粗脂肪采用索氏抽提儀(Soxtec System HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)測定?；曳趾吭隈R弗爐中550℃灼燒至恒重測定。淀粉采用GB/T 5009.9-2008的方法測定?？上苁峭ㄟ^三大營養(yǎng)素的生理熱價計算而來： 碳水化合物為4.0 kcal/g, 蛋白質(zhì)為4.0 kcal/g, 脂肪為9.0 kcal/g[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

實驗魚的終末體重(Final body weight,FBW)、特定生長率(Specific growth rate,SGR)、增重率(Weight gain,WG)、飼料系數(shù)(Feed conversion ratio,FCR)的計算公式如下：

終末體重(FBW, g)=終末總重/尾數(shù)

特定生長率(SGR, %/d)=100%×(ln魚體末重-ln魚體初重)/天數(shù)

增重率(WG, %)=100%×(魚體末重-魚體初重)/魚體初重

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量/ (魚體末重-魚體初重)

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(Means±SE)表示,所有實驗數(shù)據(jù)采用Statistica12.5 for Windows進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA), 用Duncan氏多重比較分析組間的差異顯著性, 顯著水平設(shè)為P＜0.05。

表 2 大規(guī)格(1970 g)草魚實驗料配方及營養(yǎng)組分(%以風(fēng)干樣為基礎(chǔ))Tab. 2 Formulation and nutrient contents of experimental diets of large-size (1970 g) grass carp (% air-dry basis)

2 結(jié)果

2.1 存活率

在本實驗條件和養(yǎng)殖管理下, 中規(guī)格和大規(guī)格草魚的各組存活率均為100%。

2.2 生長與飼料利用

中規(guī)格草魚的生長與飼料利用從表 3方差分析的結(jié)果可以看出, 飼料蛋白水平和淀粉添加水平均對中規(guī)格草魚的末均重、特定生長率、增重率、飼料系數(shù)均無顯著交互作用影響(P＞0.05); 而飼料蛋白水平和飼料淀粉水平分別對魚體生長和飼料利用有顯著影響(P＜0.05)。35%小麥淀粉組的生長性能顯著高于25%小麥淀粉組(P＜0.05); 同時35%淀粉組的飼料系數(shù)顯著低于25%淀粉組的(P＜0.05)。中規(guī)格草魚的生長隨著飼料蛋白水平的提高而顯著上升(P＜0.05), 其中28%蛋白組的生長性能顯著高于其他蛋白水平組的(P＜0.05); 同時28%蛋白組的飼料系數(shù)顯著低于其他蛋白組的(P＜0.05)。

圖 1中規(guī)格草魚增重率的表達趨勢清晰地顯示了淀粉對蛋白的節(jié)約效應(yīng)： 比如CP22+S35≈CP24+S25;CP24+S35≈CP26+S25。從規(guī)律性數(shù)據(jù)的表達上推測： 在圖 1所有數(shù)據(jù)點的封閉范圍內(nèi)可能存在著連續(xù)性的淀粉對蛋白節(jié)約效應(yīng)的關(guān)系。

大規(guī)格草魚的生長與飼料利用從表 4方差分析的結(jié)果可以看出, 飼料蛋白水平和淀粉添加水平對大規(guī)格草魚的末均重、特定生長率、增重率、飼料系數(shù)均無顯著交互作用影響(P＞0.05); 而飼料蛋白水平和飼料淀粉水平分別對魚體生長和飼料利用有顯著影響(P＜0.05)。40%小麥淀粉組的生長性能顯著高于30%小麥淀粉組(P＜0.05); 同時40%淀粉組的飼料系數(shù)顯著低于30%淀粉組(P＜0.05)。大規(guī)格草魚的生長隨著飼料蛋白水平的提高而顯著上升(P＜0.05), 但是當(dāng)?shù)鞍姿酱笥?0%之后差異不顯著(P＞0.05); 同時18%蛋白組的飼料系數(shù)顯著高于其他蛋白組(P＜0.05)。

圖 2大規(guī)格草魚增重率的表達趨勢清晰地顯示了淀粉對蛋白的節(jié)約效應(yīng)： 比如CP18+S40≈CP20+S30; CP20+S40＞CP22+S30。從規(guī)律性數(shù)據(jù)的表達上推測： 在圖 2所有數(shù)據(jù)點的封閉范圍內(nèi)可能存在著連續(xù)性的淀粉對蛋白節(jié)約效應(yīng)的關(guān)系。

表 3 飼料蛋白和小麥淀粉水平對中規(guī)格(460 g)草魚生長及飼料利用的影響Tab. 3 Effects of dietary protein and wheat starch on growth and feed utilization of medium-size (460 g) grass carp

2.3 肝臟組織結(jié)構(gòu)

如圖 3所示, 各處理組的中規(guī)格草魚的肝細胞形態(tài)正常, 肝細胞界限清晰且呈線性, 肝細胞核顯色清楚, 并基本位于細胞中央, 細胞質(zhì)著色明顯。5組(P28/S35)和6組(P26/S35)的高營養(yǎng)組肝臟細胞面積略大, 尤其是5組的肝臟細胞的細胞質(zhì)染色較淡, 但是基本也處于正常狀態(tài)。

圖 1 飼料蛋白水平和小麥淀粉添加水平對中規(guī)格(460 g)草魚增重率的影響Fig. 1 Effects of dietary protein and wheat starch on weight gain of medium-size (460 g) grass carp

如圖 4所示, 各處理組大規(guī)格草魚的肝臟組織結(jié)構(gòu)沒有明顯差別, 肝細胞排列整齊, 大小均一, 細胞核形態(tài)明顯, 且基本都居于細胞中間位置; 肝細胞間界限呈清晰的線形。但是大規(guī)格草魚比中規(guī)格草魚的肝臟細胞更大, 細胞質(zhì)染色也較淡。

3 討論

3.1 生長與飼料利用

國內(nèi)外有一系列關(guān)于草魚對蛋白和碳水化合物利用關(guān)系的報道。Dabrowski[2]以酪蛋白為蛋白源配置蛋白水平為15%、25%、35%、45%、55%和65%的6種配合飼料, 同時用水解淀粉填充配方空間(纖維素水平為1%), 喂養(yǎng)初始體重為0.14—0.20 g的草魚稚魚, 得出其對蛋白的需求量為占飼料的41%—43% (此時的淀粉含量約為46%)。王勝[13]以酪蛋白和明膠為蛋白源配置飼料蛋白水平分別為18%、23%、29%、34%、40%和45%的6種配合飼料, 同時用糊精填充蛋白源梯度造成的配方空間差異(纖維素水平為23.19%), 最后用折線擬合得到初始體重7.43 g的草魚的蛋白需求為39.14% (此時的糊精含量約15%)。李彬[14]研究了3種不同規(guī)格草魚的蛋白需求, 曲線擬合得到初重12.17 g草魚的蛋白需求為31.27% (此時的淀粉總含量約為44%); 初重209 g草魚的蛋白需求為26.5% (此時的淀粉總量約45%); 初重454 g草魚的蛋白需求為25.82% (淀粉總量約23%)。Jin等[3]以初重4.27 g的草魚為研究對象, 以酪蛋白和明膠為蛋白源, 以玉米淀粉為糖源,每種飼料添加20%的微晶纖維素, 結(jié)果表明蛋白水平40%, 玉米淀粉添加量為18.8%的飼料組生長性能最好。Xu等[9]以初重264 g的草魚為研究對象, 以魚粉、酪蛋白和明膠為蛋白源, 以α淀粉和玉米淀粉為糖源, 每種飼料含有5%的微晶纖維素, 結(jié)果表明獲得最大生長時的飼料粗蛋白含量為28.62% (可消化蛋白含量25.07%), 此時的飼料淀粉含量約為50%。從上述研究可以看出研究結(jié)論的差異, 不僅源于魚體規(guī)格、蛋白源、飼料脂肪水平等的不同,還源于飼料中淀粉的用量以及其與蛋白水平組合的差異。雖然Cui和Liu[15—17]對草魚的能量收支及能量需求開展了一系列的深入研究, 但是由于原料數(shù)據(jù)缺失等原因?qū)е虏蒴~配合飼料的總能設(shè)定并沒有清晰的界定。因此研究者用與蛋白質(zhì)的生理熱值相近的淀粉去平衡飼料的總能雖然具有實際的科學(xué)意義, 卻可能因為總能的設(shè)定的局限而影響草魚生長性能的繼續(xù)提升。因此, 本實驗采用了雙因子實驗設(shè)計研究蛋白與碳水化合物的關(guān)系, 2個淀粉添加水平和4個蛋白水平的正交設(shè)計形成了8個不同的飼料能量水平, 通過這種開放式設(shè)計探求草魚更高生長性能對應(yīng)的營養(yǎng)素需求水平以及淀粉對蛋白的節(jié)約效應(yīng)。

表 4 飼料蛋白和淀粉添加水平對大規(guī)格(1970 g)草魚生長及飼料利用的影響Tab. 4 Effects of dietary protein levels and wheat starch on growth and feed utilization of large-size (1970 g) grass carp

圖 3 飼料蛋白和淀粉水平對中規(guī)格草魚(460 g)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(10×40倍)Fig. 3 The effect of dietary protein and wheat starch on liver histology of medium-size grass carp (460 g, 10×40 times)

本研究實驗結(jié)果表明： (1)對中規(guī)格草魚(初重460 g/尾)而言, 飼料蛋白水平28%, 小麥淀粉添加35%時, 草魚獲得顯著高于其他各組的生長性能,此時的飼料系數(shù)低至1.03。這說明在高淀粉水平(35%)下, 28%的飼料蛋白可以很大限度的用于機體蛋白的生物合成, 體現(xiàn)了淀粉對蛋白良好的節(jié)約效應(yīng)。(2)對大規(guī)格草魚(1970 g/尾)而言, 飼料蛋白水平不能低于20%, 否則會因為氨基酸攝入的不足而影響機體生物合成。有關(guān)草魚蛋白需求的研究很多, 但是對中大規(guī)格草魚的研究, 僅有Xu等[9]指出初重264 g草魚的蛋白需求為28%; 李彬[14]認為初重209 g和454 g草魚的蛋白需求分別為26.5%和25.82%。本研究結(jié)論與這些研究結(jié)論的差異, 主要源于魚體規(guī)格、飼料營養(yǎng)結(jié)構(gòu)、以及實驗設(shè)計等的不同。(3)本研究表明, 中規(guī)格草魚飼料中的淀粉添加至少可達到35%, 大規(guī)格草魚飼料中的淀粉添加至少可達到40%。在蛋白需求的研究中, Dabrowski[2]得出草魚稚魚最佳生長時對應(yīng)的飼料淀粉含量約46%; Jin等[3]得出4.27 g初重的草魚最佳生長時對應(yīng)的飼料淀粉含量約18.8%; Xu等[9]得出264 g初重的草魚最佳生長時對應(yīng)的飼料淀粉含量約為50%; 李彬[14]得出初重12.17、209和454 g的3個規(guī)格的草魚最佳生長時對應(yīng)的飼料淀粉含量分別約為44%、45%和23%。由此可見, 由于不同的研究者采用的魚體規(guī)格、實驗料其他營養(yǎng)結(jié)構(gòu)等的不同, 導(dǎo)致獲得最佳生長的飼料組淀粉水平有較大差異(18.8%—46%)。這在草魚對淀粉的需求研究中也有證實： 潘慶等[18]認為當(dāng)飼料蛋白水平27%時,初重7.09 g草魚可以耐受35%水平的淀粉添加;Tian等[5]在飼料蛋白23%時研究6.9 g初重的草魚對小麥淀粉的需求, 結(jié)果表明飼料小麥淀粉的含量應(yīng)該低于33%。李向松[19]在飼料蛋白38%時研究6.5 g初重的草魚對玉米淀粉的需求, 結(jié)果表明飼料玉米淀粉的含量應(yīng)該低于38%。這些研究進一步證實了草食性的草魚對淀粉的耐受范圍較大, 高水平添加也不會對魚體的生長產(chǎn)生負面影響。目前草魚商品飼料中一般僅添加20%左右(折合無氮浸出物含量約15%)的谷物類原料(如小麥、大麥、木薯等)用以保證飼料加工工藝。本研究結(jié)果提示在草魚配方策略中可以考慮通過大幅提高碳水化合物水平來提升飼料效果。(4)碳水化合物對蛋白節(jié)約的另一種重要體現(xiàn)形式就是低蛋白高淀粉的合可以達到甚至超越高蛋白低淀粉組的養(yǎng)殖效果。本實驗的生長數(shù)據(jù)表明, 中規(guī)格草魚中CP22+S35≈CP24+S25, CP24+S35≈CP26+S25; 大規(guī)格草魚中CP18+S40≈CP20+S30; CP20+S40＞CP22+S30。這提示我們可以采取適當(dāng)降低蛋白提高碳水化合物的策略。雖然魚蝦對飼料中碳水化合物的利用能力不如陸生脊椎動物高, 但在飼料中適度的添加卻能夠改善魚體生長、節(jié)約蛋白質(zhì)和提高飼料利用率。其原因是碳水化合物用在體內(nèi)用于分解供能,其他營養(yǎng)素如蛋白質(zhì)就能最大化用于生長[5]。但是有關(guān)碳水化合物對蛋白的節(jié)約效率有待進一步深入精確的研究[20]。

3.2 肝臟組織結(jié)構(gòu)

圖 4 飼料蛋白和淀粉水平對大規(guī)格草魚(1970 g)肝臟組織形態(tài)的影響(10×40倍)Fig. 4 The effect of dietary protein and wheat starch on liver histology of large-size grass carp (1970 g) (10×40 times)

肝是魚類代謝和免疫的重要器官, 魚體攝入營養(yǎng)結(jié)構(gòu)不當(dāng)?shù)娘暳蠒︳~體肝臟組織造成一定的營養(yǎng)脅迫, 進而損害肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。郭小澤等[8]在飼料蛋白30%, 脂肪3%時研究高糖飼料(無氮浸出物約為42%)對初重60 g草魚的影響, 其結(jié)果顯示高糖飼料導(dǎo)致肝臟細胞嚴重腫大變形, 細胞中充滿脂肪滴, 細胞核擠壓至一側(cè), 甚至出現(xiàn)細胞核萎縮或消失, 呈現(xiàn)透明的空泡化。但是在本研究中,兩種規(guī)格的草魚肝臟組織都未受到飼料營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的顯著影響, 這可能是本實驗中飼料碳水化合物水平、魚體規(guī)格、投喂量等的不同導(dǎo)致。值得一提的是, 在本實驗條件下, 2種規(guī)格草魚的肝臟細胞中均未出現(xiàn)明顯的脂肪滴, 而本團隊在同期開展的羅非魚實驗中發(fā)現(xiàn), 在35%淀粉水平下羅非魚的肝臟細胞中就出現(xiàn)了非常明顯的脂肪滴的積累(未發(fā)表), 這也在一定程度上說明草魚對碳水化合物的耐受能力優(yōu)于羅非魚。同時, 本實驗中大規(guī)格草魚比中規(guī)格草魚的肝細胞明顯偏大, 而且細胞質(zhì)染色較淡, 說明大規(guī)格草魚較中規(guī)格草魚的肝臟代謝負荷大, 這可能是草魚生長階段的不同所致。

4 總結(jié)

在本實驗條件下, 中規(guī)格(初重460 g/尾)和大規(guī)格(初重1970 g/尾)草魚分別在飼料小麥淀粉水平35%和40%以內(nèi)時, 可以有效地利用淀粉節(jié)約飼料蛋白而不造成肝臟組織損傷, 由此可為中大規(guī)格草魚商業(yè)飼料提供多種有效的配方策略。而有關(guān)草魚利用碳水化合物節(jié)約飼料蛋白相對效率還需要進行更為精確的研究。值得一提的是, 本研究的結(jié)果在實際應(yīng)用中需要注意不同來源的無氮浸出物效價的差異以及實際生產(chǎn)中投喂率的不同。