姚晶瑞 ，姜埃利 ，王立華 ，魏 芳 ，陳海燕 ，于海波 ，孟 甲

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎臟病血液凈化科，天津300211；2.天津市海河醫(yī)院腎內(nèi)科，天津300350）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease,DKD）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）最常見的微血管并發(fā)癥之一，為引發(fā)終末期腎功能衰竭的首要原因[1-2]。研究表明，我國成人糖尿病患病率逐年增高，目前糖尿病患者人數(shù)已近1.139億，預(yù)計至2030年患者人數(shù)將超過1.8億。這些患者中超過1/3的患者有可能發(fā)展為DN以及腎功能衰竭等，因此DKD一直是T2DM患者致殘和致死的重要原因之一[3-4]。研究提示糖脂代謝紊亂所引起的氧化應(yīng)激是T2DM多種并發(fā)癥的共同機(jī)制之一。線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成過多與多種T2DM并發(fā)癥發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[5-6]。線粒體是高糖誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的重要部位。一方面，高血糖首先引起細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS生成增加，導(dǎo)致線粒體功能障礙進(jìn)而活化氧化應(yīng)激通路而引發(fā)組織損傷；另一方面，血糖升高時三羧酸循環(huán)生成大量還原性電子載體，使為ROS生成提供電子的中間物質(zhì)存在時間延長，也促進(jìn)了ROS的生成[7-8]。雷公藤甲素（triptolide,TP)是目前已知的可以從中藥雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物,也是雷公藤的主要有效藥用成分之一。雷公藤甲素具有免疫抑制、抗炎及抗腫瘤等生物活性[9-10]。近年研究結(jié)果顯示TP治療DKD也具有一定效果，推測TP主要是通過調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)通路來完成[9-11]。因此，本研究旨在從TP調(diào)控氧化應(yīng)激角度進(jìn)一步研究TP對DKD的改善作用，并探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 雷公藤甲素購自中國國家藥品生物制品檢定所。RDX2抗體購自abcam公司，腎小球系膜細(xì)胞實驗室自留。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購買自Hyclone公司。D-葡萄糖購買自天津索羅門生物科技有限公司。人腎小球系膜細(xì)胞（HRMCs）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2 實驗動物 KK-Ay小鼠30只和C57小鼠15只購買自北京華阜康科技股份有限公司。8周齡，雄性，體質(zhì)量（22±1.6）g。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 小鼠在恒定室溫和濕度條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，KK-Ay小鼠隨機(jī)分為2組，每組15只，分別為模型組和TP干預(yù)組。C57小鼠作為對照組。各組分籠喂養(yǎng)，保持自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，定期消毒。TP干預(yù)組采用灌胃的方法，每天1次，200 μg/kg/d，連續(xù)灌胃12周。對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃12周。

人腎小球系膜細(xì)胞使用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和濃度為5%的胎牛血清配制完全培養(yǎng)基，置于恒溫30℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。正常生長的人腎小球系膜細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h后，分為3組，即繼續(xù)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組、培養(yǎng)基中給予30 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)24 h的高糖組及30 mmol/LD-葡萄糖和TP（10 μg/L）共同處理24 h的干預(yù)組。

1.3.2 病理學(xué)檢查 于小鼠模型造模后12周，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下取出各組小鼠腎臟組織，10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，從腎臟組織中心部位連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色，倒置相差顯微鏡下觀察腎臟組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.3.3 氧化應(yīng)激因子檢測 小鼠模型造模后12周，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，無菌條件下取出各組小鼠腎臟組織，充分研磨消化后離心，3 000 r/min離心10 min取上清液。人腎小球系膜細(xì)胞加入0.25%胰酶消化后，血清中止消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min，將培養(yǎng)液吸凈后加入500 μL 0.01 mol/L PBS，混勻制成細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞超聲儀中進(jìn)行細(xì)胞破碎，每次5 s，連續(xù)20次，間隔10 s，總?cè)恿繛?00 μL。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定并計算丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性。

1.3.4 硫氧還蛋白過氧化物酶2（Peroxiredoxin-2，PRDX2）蛋白檢測 采用Western blot檢測方法。收集各組小鼠腎臟和各組細(xì)胞，提取蛋白后95℃變性7 min，取上清和Marker分別上樣，于10%的SDSPAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，含50 g/L脫脂奶粉TBST封閉后，以PRDX2和βactin抗體4℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析。實驗重復(fù)3次。

1.3.5 免疫熒光檢測 ROS分析試劑盒（Beyotime Biotechnology Co.Ltd，S0033-1，中國上海）是一種利用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平的試劑盒。根據(jù)說明書進(jìn)行染色分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)（IBM公司，美國），數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DKD小鼠腎臟損傷情況 觀察HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠腎臟腎小球形態(tài)規(guī)則，無明顯腎小球基底膜增厚及其他明顯病變；模型組可見小鼠腎臟腎小球體積略增大，腎小球基底膜明顯增厚、系膜基質(zhì)增生，部分腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變，而TP治療后的小鼠腎臟腎小球的上述病理改變均有不同程度改善（圖1）。

圖1 小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察Fig 1 The morphological observation of mouse glomeruli in each group

2.2 DKD小鼠腎臟氧化應(yīng)激因子的測定 ELISA檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟組織SOD活性明顯低于對照組（圖2A，P＜0.05），MDA含量明顯高于對照組（圖 2B，P＜0.05）。相對于模型組，經(jīng) TP 干預(yù)，小鼠腎臟組織中SOD活性提高，MDA含量有所減低（圖 2）。

2.3 DKD小鼠腎臟PRDX2的蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，模型組PRDX2表達(dá)量明顯低于對照組，而干預(yù)組明顯高于模型組，見圖3。

圖2 TP對DN小鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)影響Fig 2 The effects of TP on oxidative stress in mouse kidney

圖3 TP對DN小鼠腎臟PRDX2表達(dá)量的影響Fig 3 The effects of TP on PRDX2 protein expression levels in mouse kidney

2.4 人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激因子的測定 高糖組細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生明顯高于對照組，而經(jīng)TP干預(yù)后，人腎小球系膜細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生減少（圖4A）。ELISA檢測結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞SOD活性明顯低于對照組（圖 4B，P＜0.05），MDA 含量明顯高于對照組（圖4C，P＜0.05）。相對于模型組，經(jīng)TP干預(yù)，人腎小球系膜細(xì)胞中SOD活性有所升高，MDA含量有所減少（圖 4B、4C）。

圖4 TP對人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)影響Fig 4 The effects of TP on oxidative stress in human mesangial cells

2.5 人腎小球系膜細(xì)胞PRDX2的蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，人腎小球系膜細(xì)胞經(jīng)高糖誘導(dǎo)后細(xì)胞中PRDX2蛋白表達(dá)量明顯低于對照組（圖5，P＜0.05）；但高糖組細(xì)胞經(jīng)TP干預(yù)后，細(xì)胞中PRDX2蛋白表達(dá)量明顯增加（圖 5，P＜0.05）。

圖5 TP對人腎小球系膜細(xì)胞PRDX2表達(dá)量的影響Fig 5 The effects of TP on PRDX2 protein expression levels in human mesangial cells

3 討論

雷公藤是一個有著悠久歷史的中藥。TP作為雷公藤的主要活性成分之一，具有多種生物活性，其最初提取于雷公藤的根，目前已知其具有抗氧化、抗類風(fēng)濕、抗老年性癡呆癥、抗癌等功效。隨著相關(guān)領(lǐng)域?qū)2DM及其多種并發(fā)癥研究的不斷深入，近年來有學(xué)者提出TP對于DKD具有治療價值，具有潛在地改善腎臟損傷的能力[12-13]。DKD腎臟一般首先發(fā)生損傷的為內(nèi)皮細(xì)胞,隨后引起毛細(xì)血管通透性增加,蛋白等成分漏出至腎小球囊,繼而刺激壁層上皮細(xì)胞增生[14]。本研究小鼠模型腎臟的病理特征也支持此結(jié)論；研究中DKD組小鼠出現(xiàn)腎小球體積略增大，腎小球基底膜明顯增厚、系膜基質(zhì)增生，部分腎小球內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變性，而經(jīng)TP治療后的腎小球上述病理改變有不同程度改善。研究報道TP可能通過調(diào)控DKD腎臟組織氧化應(yīng)激狀態(tài)而發(fā)揮治療作用[15-16]。因此本研究亦從TP調(diào)控氧化應(yīng)激角度進(jìn)一步研究了TP對DKD的改善作用，并探討其作用的分子機(jī)制。

既往有研究選取新診斷未接受任何治療措施的T2DM患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)機(jī)體的氧化應(yīng)激程度在單純的T2DM病理背景下即表現(xiàn)出增高的特征[17]；葡萄糖不耐受個體可以通過自我調(diào)節(jié)完成糾正或者成功代償,最終保持機(jī)體的總抗氧化能力尚維系在正常范圍內(nèi)[17-18]；但是隨著胰島素抵抗指數(shù)以及體質(zhì)指數(shù)的增高機(jī)體的氧化應(yīng)激水平表現(xiàn)出明顯的增高趨勢，提示肥胖、胰島素抵抗等在破壞T2DM患者氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)過程中也發(fā)揮著重要作用[17-18]。DKD的存在又常常與胰島素抵抗等因素重疊存在[19-20]，因而DKD患者群體普遍存在氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)失衡狀況[19-21]。臨床上使用多種血生化指標(biāo)來間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，比如超氧化物歧化酶SOD可以消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD已被證實是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，同多種器官組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)關(guān)聯(lián)密切[22-23]。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中生成的一種醛類物質(zhì)，可以作為交聯(lián)劑促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)及磷脂的交聯(lián)，從而改變生物大分子的功能，因此臨床也常常通過檢測血清MDA含量來反映脂質(zhì)過氧化程度[24-25]。本研究體內(nèi)外實驗結(jié)果均顯示，與相應(yīng)對照組相比，DKD小鼠模型組腎臟中和人腎小球系膜細(xì)胞高糖刺激模型組細(xì)胞中均存在SOD活性明顯下降、MDA含量明顯增加現(xiàn)象，而TP干預(yù)后，較模型組相比，TP干預(yù)可明顯升高SOD活性和降低MDA含量，說明TP確實能抑制DKD腎臟組織中的氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

PRDX2屬于過氧化物酶家族的成員，具有利用硫氧化物還原酶作為電子供體來還原過氧化氫，清除細(xì)胞內(nèi)活性氧分子，維持機(jī)體氧化還原平衡的功能。PRDX2已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能夠通過多種信號途徑參與氧化應(yīng)激過程，特別是在不同病理背景下，機(jī)體出現(xiàn)代謝過旺，由此引發(fā)的缺氧環(huán)境使ROS增多，為了能夠在高水平活性氧環(huán)境中生存，細(xì)胞就必然需要增加抗氧化劑，因而出現(xiàn)了包括PRDX2蛋白在內(nèi)的相關(guān)因子表達(dá)變化[26-27]。既往研究提示，PRDX2過表達(dá)可以保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞凋亡，減少糖尿病發(fā)生的危險性。DKD等多種病理過程中的氧化應(yīng)激狀態(tài)變化與PRDX2表達(dá)及相關(guān)通路存在聯(lián)系,如PRDX2可經(jīng)PI3K/AKT通路參與調(diào)控腫瘤發(fā)展以及治療中的氧化應(yīng)激過程，又比如其可以通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及通過調(diào)控一些微小RNA來影響腫瘤的氧化應(yīng)激狀態(tài)等[28-30]。本研究體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示，與相應(yīng)對照組相比，DKD小鼠模型組腎臟中和人腎小球系膜細(xì)胞高糖刺激模型組細(xì)胞中均存在PRDX2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，但經(jīng)TP干預(yù)處理后，與模型組相比，PRDX2蛋白表達(dá)量被明顯增加，說明TP處理能夠上調(diào)PRDX2表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞抵抗高氧化應(yīng)激狀態(tài)的能力，有利于維持腎臟組織細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài)。

因此，本研究通過體內(nèi)外實驗結(jié)果推測TP很可能可以通過上調(diào)腎臟組織中PRDX2的蛋白表達(dá)水平來抑制了組織細(xì)胞中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而減輕DKD的腎臟損傷程度。本研究探討了TP通過上調(diào)PRDX2改善腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的分子機(jī)制，為TP的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了實驗室依據(jù)。但本研究在實驗設(shè)計方面尚存在不足之處，若能夠在TP作用人腎小球系膜細(xì)胞中下調(diào)PRDX2的蛋白表達(dá)水平，觀察在PRDX2表達(dá)被下調(diào)的情況下，TP是否失去了抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)的能力，將會增加本研究結(jié)果的說服力。但本研究也提供了未來深入探討TP用于治療DKD及其他疾病的藥理作用及其分子機(jī)制的研究方向。