張藝軍 鄒瑞 鐘武裝 蔡敏捷 許桂英 樂德 劉崗

(1中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房二科，廣東 廣州 510010；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 廣州口腔疾病研究所 口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作為一種代謝性肝損傷性疾病，其發(fā)病率正在逐年上升。長(zhǎng)期NASH可以進(jìn)一步進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，然而其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，也缺乏有效的預(yù)防措施。胰島素抵抗是公認(rèn)的產(chǎn)生NASH的重要環(huán)節(jié)。研究提示，血管緊張素(Ang)(1～7)能在一定程度上改善細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，從而抑制NASH的進(jìn)展〔1〕。但Ang(1～7)與胰島素受體底物(IRS)1/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲/蘇氨酸激酶(Akt)胰島素信號(hào)通路之間的調(diào)控關(guān)系還尚未見系統(tǒng)研究。本研究擬分析IRS1/PI3K/Akt信號(hào)通路在Ang(1～7)調(diào)節(jié)NASH中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(GIBCO，美國(guó))，胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國(guó))，油酸(賽哲生物，廣州),二甲基亞砜(DMSO，賽哲生物，廣州)，油紅(賽哲生物，廣州)，Ang(1～7)(PhoenixBiotech,德國(guó))，AngⅡ(Sigma，美國(guó))，A779(晶欣，深圳)，總膽固醇試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α購(gòu)自CUSABIO(武漢)，AKT1(AF0836)、PI3K抑制劑(AF6241)、兔PI3-kinase(AF6241)、兔IRS1(AF6273)及多克隆抗IRS1抗體購(gòu)自美國(guó)AFFINITY公司 ，人肝細(xì)胞L02細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2NASH體外模型建立 L02細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入20 mg/ml油酸(以0.5%DMSO溶解)誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性，隔天換液并加入新配制的油酸。分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，72 h后細(xì)胞發(fā)生脂肪變。光鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪油紅染色情況。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、Ang(1～7)處理組、AngⅡ處理組、Ang(1～7)+A779處理組，每組細(xì)胞數(shù)約5×106個(gè)。對(duì)照組為脂肪變肝細(xì)胞，未加任何干預(yù)因素。處理組分別加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L Ang(1～7)和10-6mol/L MAS拮抗劑(A779)共同干預(yù)及10-6mol/L AngⅡ干預(yù)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)。每組分別重復(fù)3次測(cè)量。

1.4檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、ALT、總膽固醇、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)含量 將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)，分別加入10-6mol/L Ang(1～7)，10-6mol/L AngⅡ及10-6mol/L Ang(1～7)和 10-6mol/L MAS拮抗劑(A779)共同干預(yù)，對(duì)照組不加任何試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再收集細(xì)胞的上清液。按照說明書操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、ALT、總膽固醇、GULT4的含量。

1.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)IRS1 mRNA表達(dá) 總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,引物設(shè)計(jì)為β-actin上游引物：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。IRS1上游引物：5′-AAGCACCTATGCCAGCATCAAC-3′，下游引物:5′-GAGGATTGCTGAGGTCATTTAGGTC-3′。RT 和PCR體系均為25 μl。反應(yīng)條件:95℃ 變性 30 s,60℃ 退火60 s,72℃ 延伸15 s,40個(gè)循環(huán)。 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,EPSON Perfection 2480 Photo掃描儀(愛普生公司產(chǎn)品)掃描條帶,SmartView 2000生物電泳圖像分析軟件(上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品)對(duì)條帶密度進(jìn)行密度定量分析,與標(biāo)準(zhǔn)化的β-actin條帶密度掃描值作對(duì)比后測(cè)定其表達(dá)情況。

1.6Western印跡檢測(cè)PI3K及Akt蛋白表達(dá) 取30 μg蛋白上樣，10%分離膠和5%濃縮膠電泳。350 mA進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)移。一抗封閉后過夜，再二抗孵育1 h。洗膜后置暗室中，等體積混合發(fā)光緩沖液A與B，均勻滴加到聚偏氟乙烯(PVDF)膜的蛋白面上。壓X光膠片1～10 min，顯影后定影，Gel-ProAnalyzer分析蛋白條帶的灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1脂肪變肝細(xì)胞的構(gòu)建 脂肪變肝L02細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，可見大量脂質(zhì)集聚的紅染顆粒積聚，見圖1。

2.2各組總膽固醇、ALT、GLUT4的變化情況 Ang(1～7)組總膽固醇、ALT含量顯著低于陰性對(duì)照組，GLUT4含量顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。AngⅡ組、Ang(1～7)+A779組總膽固醇、ALT、GLUT4含量與陰性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3各組IRS1基因活性、磷酸化(p)-PI3K、Akt及TNF-α的表達(dá)變化 Ang(1～7)組IRS1基因活性增強(qiáng)，p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平升高，TNF-α表達(dá)量下降，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AngⅡ組與Ang(1～7)+A779組IRS1基因活性減弱，p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平下降，AngⅡ組TNF-α表達(dá)量升高，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 經(jīng)油紅染色的NASH細(xì)胞模型(×400)

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、總膽固醇、GLUT4水平比較

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各組IRS1、p-PI3K、p-Akt、TNF-α表達(dá)量比較

3 討 論

NASH正成為全球最常見的慢性肝病，其患病率為20%～30%，在一些特殊人群中其患病率更高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2型糖尿病患者中有70%合并該病，而在肥胖者中其患病率高達(dá)90%〔2〕,NASH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜〔3,4〕。2004年，Wang等〔5〕首次提出胰島素抵抗的定義，并認(rèn)為胰島素信號(hào)傳遞受阻或減弱，是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要原因。胰島素抵抗可減弱和破壞胰島素對(duì)脂肪代謝的調(diào)節(jié)，增加脂質(zhì)溶解，提高循環(huán)中游離脂肪酸濃度，促進(jìn)肝臟游離脂肪酸的攝取和肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的合成，促使三酰甘油在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，導(dǎo)致NASH的形成〔6〕。Promrat 等〔7〕發(fā)現(xiàn)胰島素增敏劑可使NASH患者的生化指標(biāo)和肝臟組織學(xué)特征獲得改善。迄今，胰島素抵抗被公認(rèn)為NASH的核心機(jī)制。NASH發(fā)病機(jī)制的“二次打擊”假說〔8〕認(rèn)為，脂肪蓄積通過脂毒性作用，誘導(dǎo)過氧化作用、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、纖維化等二次打擊的發(fā)生。脂肪組織(尤其是內(nèi)臟性脂肪)的增加伴隨胰島素增敏因子、抗炎因子的減少及致炎因子的增加，炎癥因子反過來通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌代謝而增強(qiáng)胰島素抵抗。 Najjar等〔9〕證明，單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1通過募集巨噬細(xì)胞在脂肪組織中產(chǎn)生炎癥，加重脂肪肝和胰島素抵抗。在動(dòng)物模型和NASH患者中，肝臟核因子(NF)-κB表達(dá)顯著增加，活化的NF-κB通過上調(diào)白細(xì)胞介素(IL)-6、TNF-α等水平介導(dǎo)肝臟炎癥，加重胰島素抵抗。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)廣泛存在于各種組織器官。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-AngⅡ- AngⅡ 1型受體軸(AT1R)是其主要分支。多項(xiàng)研究證實(shí)〔10～12〕，ACE抑制劑和AngⅡ受體阻斷劑可以阻斷2型糖尿病的進(jìn)展，發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用。ACE2-Ang(1～7)-MAS軸作為RAS分支，抑制ACE-AngⅡ-AT1R軸的內(nèi)在調(diào)節(jié)途徑，對(duì)多種組織器官具有保護(hù)作用〔13～15〕。Ang(1～7)在體內(nèi)外與AT1R競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，拮抗AngⅡ活性，被認(rèn)為是內(nèi)源性AngⅡ的阻斷劑〔16〕。 Ang(1～7)可以完全阻斷AngⅡ?qū)δI近曲小管上皮細(xì)胞、人內(nèi)皮細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2的磷酸化作用，該阻斷作用可以被MAS受體阻斷劑A779所抑制。

本研究提示，AngⅡ能對(duì)肝細(xì)胞造成持續(xù)性損傷，Ang(1～7)有改善肝細(xì)胞功能的作用。 A779作為Ang(1～7)的拮抗劑，阻斷Ang(1～7)對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，具有反向調(diào)節(jié)功能。GLUT4是一類嵌于細(xì)胞膜上用于轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的蛋白質(zhì)載體，在機(jī)體攝取葡萄糖及代謝葡萄糖過程中發(fā)揮重要作用，葡萄糖的代謝取決于細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，其表達(dá)水平直接影響機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用，也被稱為胰島素反應(yīng)性蛋白〔17〕。進(jìn)一步研究抑制胰島素抵抗的分子調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)，脂肪變肝細(xì)胞L02細(xì)胞中IRS1基因表達(dá)升高，p-PI3K、Akt表達(dá)水平升高，TNF-α水平下降。在IRS1/PI3K/Akt信號(hào)通路中，IRS1是一種能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，機(jī)體內(nèi)的胰島素通過特異性地結(jié)合胰島素受體，激活I(lǐng)RS1等底物進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控血糖的作用。而PI3K/Akt信號(hào)通路是經(jīng)典的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑〔18〕,當(dāng)胰島素與細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合后，激活I(lǐng)RS1蛋白酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而使PI3K磷酸化，產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，使得Akt磷酸化被激活，并促使GLUT4轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收。相反，則可能導(dǎo)致胰島素抵抗〔19〕。Zhang等〔20〕研究表明， 一種肝臟保護(hù)劑(SIL)能夠通過IRS1/PI3K/Akt 信號(hào)通路改善脂肪變肝細(xì)胞和胰島素抵抗。也有研究表明，當(dāng)IRS1/PI3K/Akt信號(hào)通路被激活后，能夠?qū)⒏嗟腉LUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，從而增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取〔21〕，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說明Ang(1～7)還可以通過PI3K/Akt/TNF-α信號(hào)途徑降低肝細(xì)胞凋亡，改善NASH。

綜上，Ang(1～7)可以通過IRS1/PI3K/Akt信號(hào)通路提高細(xì)胞膜GLUT4含量，同時(shí)減少TNF-α的表達(dá)，減少肝細(xì)胞中膽固醇、ALT含量，改善胰島素抵抗，從而達(dá)到減輕NASH的作用。