吳林 唐農(nóng) 麻小梅 陳煒 鄭?？?趙海濤 白碩宇 曾冬娟 楊惠丹 鄧燕

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

在導(dǎo)致癡呆的眾多病因中，血管性癡呆(VD)是僅次于阿爾茨海默病(AD)的第二大病因，為老年人的多發(fā)病，VD給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已引起國(guó)內(nèi)外的極大關(guān)注，至今仍沒有確實(shí)有效的藥物治療VD，因此，積極探尋防治VD的有效途徑，具有重要的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。研究已表明VD的學(xué)習(xí)記憶功能障礙與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡有關(guān)，Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白的改變最終可導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過制作VD模型大鼠，對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行研究，探討溫肺降濁方改善VD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡健康雄性SPF級(jí)SD大鼠120只，體重(200±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)。

1.2主要設(shè)備及試劑 日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的CX-31型電子顯微鏡，由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的WMT-100型Morris水迷宮設(shè)備全套，美國(guó)Media Cybernetics公司生產(chǎn)的多功能圖像分析管理系統(tǒng)，德國(guó)萊卡生產(chǎn)的RM2015型全自動(dòng)石蠟切片機(jī)，美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的CA91786型 UVP凝膠成像系統(tǒng)，DAB(北京中杉金橋公司生產(chǎn)，批號(hào)：ZLI-9032)，胃蛋白酶 Pepsin(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：BS0096)，TUNEL試劑盒(美國(guó)ROCHE生物科技公司生產(chǎn)，批號(hào)：11684817910)，Bcl-2抗體(美國(guó)Millpore公司生產(chǎn)，批號(hào)：AB1722)，Bax抗體(美國(guó)Millpore公司生產(chǎn)，批號(hào)：04-434)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品 溫肺降濁方，由制附子20 g，黨參15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黃10 g，田七10 g共6味中藥組成，(由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：1406033)。石杉?jí)A甲片(浙江震元制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20033718)。頭孢羥氨芐甲氧芐啶膠囊(哈藥集團(tuán)三精制藥諾捷有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20056737)，用于造模術(shù)后預(yù)防感染。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1VD模型大鼠制備 隨機(jī)從合格的大鼠抽出16只作為假手術(shù)組，其余104只大鼠進(jìn)行VD模型大鼠的制備。參照Ni等〔2〕的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(2-VO)法將大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈用4～0無菌蠶絲線永久性結(jié)扎制作VD動(dòng)物模型。假手術(shù)組腹腔注射麻醉后行分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈手術(shù)操作，但不結(jié)扎，其余操作及術(shù)后處理與模型組相同。

1.4.2Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn) 各組大鼠按第1、第2、第3、第4象限的順序，將大鼠面向池壁(大鼠頭部向上，以防溺水)依次放入水中，設(shè)計(jì)大鼠進(jìn)駐平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期時(shí)間)為60 s，記錄其60 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)(大鼠找到平臺(tái)并滯留其上5 s為成功)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，讓它在平臺(tái)上停留10 s再取出來，且記錄大鼠逃避潛伏期時(shí)間為60 s。每只大鼠每天訓(xùn)練4次(上、下午各2次)，連續(xù)5 d。取4個(gè)象限逃避潛伏期時(shí)間的均數(shù)作計(jì)算。

1.4.3造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 參照趙憲林等〔3〕的VD模型大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，即以假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期時(shí)間的均值為參考值，計(jì)算模型組大鼠各鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比例，該值>20%定為合格的VD大鼠。

1.4.4實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表，本次實(shí)驗(yàn)將合格的75只VD模型大鼠隨機(jī)分到模型組15只，溫肺降濁方低劑量組15只，溫肺降濁方中劑量組15只，溫肺降濁方高劑量組15只，石杉?jí)A甲組15只。

1.4.5灌胃給藥 于造模后第15天開始灌胃給藥，大鼠灌胃藥物劑量的換算方法，均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定。給藥劑量以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，溫肺降濁方低、中、高劑量組大鼠的給藥劑量分別為3.75、7.50、15.00 g/(kg·d)，石杉?jí)A甲組給藥劑量為0.15 mg/(kg·d)，灌胃濃度每天按1 ml/100 g大鼠體重進(jìn)行。其中假手術(shù)組及模型組均予相應(yīng)體積的雙蒸水灌胃。所有大鼠灌胃給藥均為1次/d，共30 d。

1.4.6TUNEL染色 每組隨機(jī)取7只大鼠進(jìn)行心臟灌注取腦，先后用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛進(jìn)行灌注后，取全腦組織，分別裝入有4%多聚甲醛的標(biāo)本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①經(jīng)固定后的腦組織，常規(guī)石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度約4 μm。②切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗。③用胃蛋白酶Pepsin孵育。④滴加50 μl的TUNEL反應(yīng)混合溶液標(biāo)記并進(jìn)行孵育。⑤加入50～100 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液顯色。⑥再用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。⑦1%鹽酸酒精分化。⑧1%氨水反藍(lán)。⑨常規(guī)脫水，透明，封片。⑩在光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為胞體呈三角形或不規(guī)則形，形態(tài)縮小，核固縮深染，細(xì)胞核中有藍(lán)褐色顆粒者為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，而陰性神經(jīng)元的胞核則不顯示成藍(lán)褐色。在每張切片同一區(qū)域中隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊的視野進(jìn)行觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI)，AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.7Western印跡實(shí)驗(yàn) 將大鼠進(jìn)行斷頭低溫新鮮取腦，在冰臺(tái)上快速分離出雙側(cè)海馬，立即置于2 ml EP管中，然后放入-80℃液氮中保存，各組大鼠取材完畢后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存標(biāo)本，為組織蛋白的提取做準(zhǔn)備。①制備十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。②樣品的變性及電泳。③凝膠轉(zhuǎn)膜及其檢測(cè)，恒流250 mA轉(zhuǎn)膜，在含有5%的脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。將封閉后的膜直接放入稀釋后的一抗工作液(Bcl-2、Bax及抗β-actin的抗體)中，4℃反應(yīng)過夜。用1×PBST洗膜3次。將二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀釋3 000倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次。④曝光及洗片。經(jīng)顯影定影液顯色，根據(jù)條帶的亮度及背景情況可以再次選擇曝光時(shí)間進(jìn)行二次曝光。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值。用所測(cè)蛋白(Bcl-2、Bax)的灰度值分別與內(nèi)參照β-actin的灰度值比較，所得的比值表示所測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況觀察 經(jīng)過30 d藥物灌胃治療后，觀察到溫肺降濁方中、高劑量組和石杉?jí)A甲組大鼠恢復(fù)至術(shù)前正常飲食，精神活動(dòng)可，反應(yīng)比較敏捷，毛發(fā)也較前潤(rùn)澤，其中溫肺降濁方高劑量組大鼠反應(yīng)較溫肺降濁方中劑量組、石杉?jí)A甲組迅速，一有動(dòng)靜即睜眼，跑到柵欄張望；而溫肺降濁方低劑量組大鼠只是稍許睜眼；模型組大鼠絕大多數(shù)在原地不動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，目光呆滯，存在少食少飲，體重減輕，毛發(fā)枯黃無澤的表現(xiàn)；假手術(shù)組大鼠行為活動(dòng)，進(jìn)食及精神狀況等均正常，且性格好動(dòng)，時(shí)常打斗。

2.2TUNEL結(jié)果 模型組海馬CA1區(qū)可見大量分布的陽(yáng)性細(xì)胞，極少見有正常的神經(jīng)細(xì)胞，其AI〔(64.75±2.02)%〕明顯高于假手術(shù)組〔(7.72±1.69)%〕、溫肺降濁方低、中、高劑量組〔(35.30±3.09)%、(23.61±3.02)%、(11.24±3.48%)〕和石杉?jí)A甲組〔(17.03±2.61)%,均P<0.01〕；組間比較發(fā)現(xiàn)：溫肺降濁方三劑量組組間AI比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與石杉?jí)A甲組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；石杉?jí)A甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組抗VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用最為明顯，其次是石杉?jí)A甲組，見圖1。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)病理改變(TUNEL染色，×400)

2.3各組海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá) 模型組較假手術(shù)組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。石杉?jí)A甲組、溫肺降濁方低、中、高劑量組與模型組比較，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。組間比較發(fā)現(xiàn)：溫肺降濁方低、中、高劑量組三者組間Bcl-2蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與石杉?jí)A甲組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；石杉?jí)A甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；溫肺降濁方高劑量組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組增加Bcl-2蛋白表達(dá)的作用最為顯著。見表1，圖2。

2.4各組海馬組織Bax蛋白表達(dá) 模型組較假手術(shù)組Bax蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。石杉?jí)A甲組、溫肺降濁方低、中、高劑量組與模型組比較Bax蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間比較發(fā)現(xiàn)：溫肺降濁方低、中、高劑量組三者組間Bax蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；溫肺降濁方高劑量組與假手術(shù)組、石杉?jí)A甲組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；石杉?jí)A甲組與溫肺降濁方中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各藥物組中，以溫肺降濁方高劑量組抑制Bax蛋白表達(dá)的作用最為顯著。見表1，圖2。

表1 各組海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.01;與石杉?jí)A甲組比較：3)P<0.01;與溫肺降濁方高劑量組比較：4)P<0.01;與溫肺降濁方低劑量組比較：5)P<0.01

1：假手術(shù)組；2：模型組；3：溫肺降濁方低劑量組；4：溫肺降濁方中劑量組；5：溫肺降濁方高劑量組；6：石杉?jí)A甲組圖2 各組海馬組織Bcl-2、 Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

海馬是大腦高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)組成之一，在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著十分的重要作用〔4〕。研究表明，海馬各段解剖組織對(duì)缺血的易損傷性分別依次為CA1>CA2>CA3>齒狀回〔5〕。海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)生的遲發(fā)性壞死(細(xì)胞凋亡)可能是缺血性相關(guān)腦血管疾病導(dǎo)致癡呆的主要原因〔6〕。海馬以CA1區(qū)與學(xué)習(xí)記憶及空間辨別的關(guān)系是最為密切的，故本研究選取海馬CA1區(qū)進(jìn)行病理研究，結(jié)果表明模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體縮小，核固縮深染，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂，神經(jīng)元大量凋亡、丟失，而溫肺降濁方低、中、高劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元異常改變較模型組明顯減輕，可見VD的學(xué)習(xí)記憶障礙與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡有十分密切的關(guān)系。

細(xì)胞凋亡的病理機(jī)制十分復(fù)雜，凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制目前尚不完全清楚，凋亡的發(fā)生既是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，又受許多內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)。在缺血缺氧的情況下，既可引起神經(jīng)細(xì)胞的壞死，也可造成神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡〔7〕。凋亡在缺血性神經(jīng)細(xì)胞脫失中起重要的作用〔8〕，實(shí)驗(yàn)研究〔9〕發(fā)現(xiàn)慢性缺血癡呆大鼠的海馬中有明顯的細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的學(xué)習(xí)與記憶障礙。因壞死是具有不可逆轉(zhuǎn)性，而凋亡則具有可塑性，另外細(xì)胞凋亡的發(fā)生需要一定的時(shí)間，這就為VD的治療創(chuàng)造了很好的機(jī)會(huì)，并有助于發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)的新分子靶目標(biāo)。細(xì)胞凋亡的最初標(biāo)志是形態(tài)學(xué)上的變化，TUNEL法能準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)有很強(qiáng)的特異性。在TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，模型組大鼠出現(xiàn)大量成簇的神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)元凋亡數(shù)目較各組明顯增多，而溫肺降濁方低、中、高劑量組對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目與模型組比較，均有不同程度減少，而且存在一定量效關(guān)系，以溫肺降濁方高劑量組的作用最為顯著，說明溫肺降濁方具有抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，保護(hù)神經(jīng)元的作用。

Bax和Bcl-2均是Bcl-2家族的重要分子，Bax的作用與Bcl-2相反、相互拮抗，Bcl-2和Bax的表達(dá)強(qiáng)度決定著細(xì)胞的最終命運(yùn)。當(dāng)Bax過量表達(dá)則細(xì)胞凋亡，Bcl-2過量表達(dá)則細(xì)胞存活。Bax蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞色素C自線粒體釋放，導(dǎo)致凋亡發(fā)生的一系列復(fù)雜的“瀑布”式反應(yīng)，且提示細(xì)胞凋亡傾向增加，Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，Bcl-2的作用占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞色素C不釋放入胞質(zhì)，線粒體凋亡路徑不起作用。Bcl-2水平升高提示細(xì)胞凋亡概率下降，反之細(xì)胞凋亡傾向則會(huì)增加〔10〕。研究認(rèn)為，從分子水平層面促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)、抑制Bax蛋白的表達(dá)，可能是抑制神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡、避免腦缺血后VD發(fā)生的有效途徑之一〔11〕。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，溫肺降濁方可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)Bcl-2抗凋亡作用，減輕Bax的促凋亡作用，進(jìn)而抑制VD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。