(長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025) (長江大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 荊州 434023)

枸杞(LyciumchinenseMill)為茄科枸杞屬的一種多年生落葉小灌木植物，是我國傳統(tǒng)的中藥材，同時還是國家衛(wèi)生部公布的可藥食同源的植物品種之一[1]。干燥成熟的枸杞子含類胡蘿卜素、多糖、脂肪酸、黃酮和多酚等多種活性成分，此外還含有18種氨基酸及鐵、磷、鋰等多種微量元素，具有很高的藥用價值和保健價值[2, 3]。因此，枸杞種植產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，特別是我國西北地區(qū)的枸杞種植已形成產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化模式，是該地區(qū)的重要經(jīng)濟來源產(chǎn)業(yè)。近年來，由于枸杞種植面積的不斷擴大，病害的發(fā)生也日益嚴重。其中枸杞白粉病的發(fā)生非常普遍，病害發(fā)生初期會在葉片上形成小范圍白色霉斑，發(fā)生嚴重時枸杞植株會呈現(xiàn)出一片白色，阻礙植株進行光合作用及呼吸作用，最終導致植株葉片變黃、脫落甚至整株死亡[4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)枸杞分布廣泛，多分布于公園及野生自然環(huán)境，白粉病危害嚴重，影響了其觀賞和生態(tài)價值。為此，筆者通過形態(tài)學和分子生物學方法對侵染北京地區(qū)枸杞白粉病的病原進行鑒定，旨在為白粉病的防治和其病原分類鑒定等提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枸杞白粉病病原菌樣品于2016年10月與2017年9月分別采自北京香山公園、北京植物園、中國農(nóng)業(yè)科學院院內(nèi)、八達嶺長城公園等10個地方。

1.2 病原菌顯微形態(tài)鑒定

采集白粉病癥狀嚴重的枸杞葉片進行病原菌顯微觀察：取感病嚴重葉片于體視鏡觀察，挑取白粉菌成熟閉囊殼，制備臨時玻片標本，于顯微鏡下觀察閉囊殼形態(tài)，拍照保存。

1.3 病原菌分子生物學鑒定

1.3.1 總DNA的提取

用液氮研磨感病葉片，加入提前預熱的2%CTAB 1mL，混勻，65℃加熱30min(間隔搖動)；4℃、12000r/min離心10min，取上清，加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，4℃、12000r/min離心10min；取上清，加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，4℃、12000r/min離心10min；取上清，加等體積的異丙醇，于-20℃放置1h，4℃、12000r/min離心10min；去上清留沉淀，之后用70%乙醇清洗沉淀2次，采用真空干燥機干燥3～5min后，溶于適量無菌ddH2O中，-20℃下保存[5]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總DNA的完整性。

1.3.2 ITS區(qū)域序列PCR擴增

ITS區(qū)域序列(包含internal transcribed spacer 1、5.8s ribosomal DNA gene和internal transcribed spacer 2全序列以及18s和28s ribosomal DNA gene部分序列)的PCR擴增采用專用白粉菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、PM6(5’-GYCRCYCTGTCGCGAG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)、PM5(5’-TTGCTTTGGCGGGCCGGG-3’)[6]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應體系20μL：模板DNA 0.5μL，引物ITS1和ITS4各1μL，2×HiFi Taq Mix 10μL，ddH2O 7.5μL。PCR反應條件：95℃預變性3min，95℃變性15s，54℃退火20s，72℃延伸1min，循環(huán)36次，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5μg/L EB 10μL染色)進行檢測。

1.3.3 PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序

將獲得的目的條帶利用膠回收純化試劑盒(參照TaKaRa DNA Fragment Purification Kit試劑盒說明)純化后構建到PMD18-T載體上并轉化至EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)過菌落PCR驗證后，將獲得的陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.3.4 序列分析

將獲得的測序在NCBI上進行BLASTn，下載與該序列同源性高的ITS序列，使用Clustal X軟件進行全序列匹配，用MEGA 6.1軟件對序列進行分析，基于Kimura-2-Para-meter雙參數(shù)模型，采用NJ法(neighborhood-joining)構建系統(tǒng)進化樹并分析親緣關系。

2 結果與分析

2.1 白粉病病原菌的形態(tài)觀察

白粉菌侵染枸杞后主要會感染枸杞植株葉片的兩面、葉柄等部位，感染初期會在葉片上形成圓形菌斑，嚴重時葉片甚至整個植株都布滿白色粉狀物，影響植株進行光合作用(見圖1(a)和圖1(b))，侵染后期會產(chǎn)生許多黑色小粒點，即為病原菌有性世代閉囊殼(見圖1(c))。成熟后閉囊殼為暗褐色，直徑為110.5～168.4μm，附屬絲較多并生于閉囊殼的‘赤道’部位，常相互交織在一起，長度為閉囊殼直徑的0.5～1.8倍，長度為60.4～220.4μm，閉囊殼頂端1～3次二叉或三叉狀分支，第一次分叉接近中部或下部，并在第一次分叉上進行第二次分叉，第二次分叉短且疏松，頂端鈍圓或收縮，無色，壁薄。該閉囊殼形態(tài)與穆氏節(jié)絲殼(Arthrocladiellamougeotii(Lév.) Vassilk)有性態(tài)描述基本一致[7]，所以初步鑒定其為穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。

2.2 白粉病病原菌的分子生物學鑒定

采用白粉菌通用引物ITS1和PM6、ITS4和PM5 2對引物去進行ITS區(qū)段擴增，經(jīng)PCR擴增出500～750bp之間的目的片段(見圖2)。通過測序和序列分析，10個采樣地點的rDNA ITS序列一致，長度為593bp(GenBank登錄號為MG757562.1)，其中，1～30bp為部分18S rDNA序列，31～218bp為ITS1全序列，219～372bp為5.8S rDNA全序列，373～534bp為ITS2全序列，534～593bp為部分28S rDNA序列。將獲得的序列于GenBank中進行BLASTn，顯示其ITS序列與GenBank中的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)的ITS序列同源性大于99.8%，而與其他白粉菌ITS序列的同源性小于91.0%。

圖1 枸杞白粉病的發(fā)病癥狀及顯微形態(tài)結構

在NCBI的GenBank中搜索并下載相關白粉菌ITS序列，進行同源比對分析和構建系統(tǒng)進化樹(見圖3)。結果顯示，其與節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼中國菌株(JX546296.1、KP420475.1)、日本菌株(AB022380.1)、韓國菌株(AF455748.1)、土耳其菌株(KX017568.1)、澳大利亞菌株(AF073358.1)聚為一支，自展支持率達100%，親緣關系最為接近，但與同族下的白粉菌(高氏白粉菌屬(Golovinomyces)及新白粉菌屬(Neoreysiphe))，如Golovinomycesambrosiae(KX987303.1)、Golovinomycesbiocellatus(FJ874774.1)、Golovinomycesorontii(AB769458.1)、Neoerysiphegaleopsidis(KR261582.1)、Neoerysiphegeranii(KR048092.1)等的ITS序列親緣關系相對較遠。鑒于節(jié)絲殼屬只含穆氏節(jié)絲殼1個種，根據(jù)以上結果，鑒定來自北京地區(qū)的枸杞白粉病病原菌為穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。

M:DL2000；1和2:ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物圖2 枸杞白粉病病原菌ITS的PCR擴增電泳圖 圖3 依據(jù)ITS序列構建的白粉病病原菌NJ系統(tǒng)進化樹

3 討論與結論

對來自于北京地區(qū)10個地點的枸杞白粉病病原菌進行了形態(tài)學觀察，結果發(fā)現(xiàn)這10個地點的白粉菌有性世代閉囊殼與穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)有性世代描述的特點[7]基本一致。由于穆氏節(jié)絲殼是節(jié)絲殼屬下的唯一種，因此初步認為北京地區(qū)的枸杞白粉病病原菌為節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)，這與已經(jīng)報道的來自不同國家，如日本、澳大利亞、中國等地區(qū)的枸杞白粉菌菌株是一致的[8]。ITS序列作為一種遺傳標記，具有明顯優(yōu)越性，ITS區(qū)受外界環(huán)境影響小，進化速度快，不但具有保守性而且在科、屬、種水平上具有差異性，能夠為病原菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供重要依據(jù)[9]。通過ITS序列比較及系統(tǒng)進化樹分析等方法進一步鑒定北京地區(qū)枸杞白粉病病原菌，結果顯示其與來自日本、韓國、土耳其等國家的枸杞白粉菌菌株的ITS序列同源性達99.8%以上，親緣關系最為接近，在進化樹中形成自展支持率為100%的分枝，由此進一步確定了該白粉菌為節(jié)絲殼屬的穆氏節(jié)絲殼(A.mougeotii)。同時，由系統(tǒng)進化樹也可以看出節(jié)絲殼屬與同族的高氏白粉菌屬親緣關系相對較近，而與同族的新白粉菌屬親緣關系相對較遠[10]。該研究鑒定了北京地區(qū)枸杞白粉病病原菌，對于枸杞白粉病的防治和探究高氏白粉菌族系統(tǒng)進化關系有著重要作用。