張馨默，劉麗萍*

（1.黑龍江大學(xué)/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150000）

丁香的雌配子體（megagametophyte）是丁香胚珠的主要核心結(jié)構(gòu)，利用微分離技術(shù)制片觀察丁香雌配子體減數(shù)分裂行為的發(fā)生機(jī)制。減數(shù)分裂是丁香胚珠發(fā)育過程中的關(guān)鍵時(shí)期。丁香雌配子體的成熟和卵細(xì)胞的正常發(fā)生，可對(duì)寒地丁香的生長生殖和發(fā)育起主導(dǎo)作用。因此，對(duì)寒地丁香大孢子母細(xì)胞時(shí)期的胚珠發(fā)育機(jī)制進(jìn)行研究，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

目前，調(diào)控胚珠發(fā)育的分子機(jī)制已見報(bào)道，但利用微分離技術(shù)對(duì)丁香大孢子母細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制進(jìn)行的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。課題組在微分離丁香胚珠的過程中發(fā)現(xiàn)丁香的胚囊有分隔，并一分為四，隔為十字交叉，每個(gè)隔內(nèi)都有1個(gè)胚珠，認(rèn)為這一現(xiàn)象是多種基因共同調(diào)控表達(dá)的結(jié)果。是丁香的功能基因綜合表達(dá)的產(chǎn)物，直接體現(xiàn)丁香生長發(fā)育的調(diào)控特點(diǎn)。因此，本文采用形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)等研究手段，對(duì)寒地丁香雌配子體有絲分裂期的胚珠進(jìn)行制片研究，以揭示寒地丁香雌配子體有絲分裂調(diào)控機(jī)制。

研究結(jié)果：對(duì)寒地丁香的大孢子母細(xì)胞發(fā)生發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)觀察，準(zhǔn)確掌握了丁香胚珠發(fā)育的數(shù)量，得到主要結(jié)果如下，當(dāng)寒地丁香花絮約為8.0 mm時(shí)，腋芽原基發(fā)育，入冬后花芽休眠。至第2年春季4～5月，花絮約為6.0 mm時(shí)，胚珠細(xì)胞分化。在胚囊約為5.0 mm時(shí)，大孢子母細(xì)胞分化；約為11.0 mm時(shí)，胚珠體細(xì)胞中當(dāng)雌配子體開始形成細(xì)胞壁時(shí)，頸卵器原始細(xì)胞分化；約為43.0 mm時(shí)，頸卵器、卵細(xì)胞發(fā)育成熟，雌配子體細(xì)胞化完成；約為45.0 mm時(shí)，受精作用發(fā)生。胚囊內(nèi)即可觀察到成熟胚。在丁香大孢子母細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育過程中對(duì)處于雌配子體旺盛分裂期的丁香胚珠進(jìn)行了微分離技術(shù)的分離分析。最終在上百個(gè)胚囊中分離胚珠大約400個(gè)。有30個(gè)胚珠中處于雌配子體分裂前、后期的丁香胚珠。它們?cè)谟薪z分裂期，胚珠內(nèi)的物質(zhì)供給短缺和能量代謝異常共同導(dǎo)致了蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制發(fā)生異常。在胚珠遭受氧化脅迫時(shí)，與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋胚珠細(xì)胞最終開啟了細(xì)胞程序化死亡進(jìn)程，導(dǎo)致雌配子體游離核有絲分裂失敗。

我國對(duì)丁香的研究主要集中在新品種培育和栽培管理等方面，而對(duì)丁香胚珠解剖及微分離方面的研究幾乎是空白。本次實(shí)驗(yàn)將結(jié)合觀測(cè)丁香花、葉的組成結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)、微分離制片觀察技術(shù)明確丁香花的胚珠數(shù)、各部位結(jié)構(gòu)，以便研究丁香的生殖發(fā)育特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)的材料為丁香，主要對(duì)丁香的胚珠進(jìn)行微分離以及花粉的形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)和解剖研究。

1.2 方法

1.2.1 花的解剖方法 利用人工方法對(duì)丁香花的外部形態(tài)（花瓣、花萼、花托、花柱等）進(jìn)行解剖測(cè)量和觀察，通過多組實(shí)驗(yàn)求平均值（見表1）。

表1 丁香花卉的測(cè)量（平均值）（單位：cm）

1.2.2 花粉制片方法 取樣，解剖鏡分離丁香的花藥進(jìn)行制片，經(jīng)改良品紅染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察。丁香花粉呈單粒存在，為橢圓形細(xì)胞，被染成淡紫色，拍照保存。

1.2.3 葉片徒手切片方法徒手切片是將新鮮的或固定的實(shí)驗(yàn)材料制成薄片的方法。切片時(shí)需要用左手固定好丁香的葉片，一般葉片需要伸出食指2～3mm，避免切到手指。右手在切片的時(shí)候需要與實(shí)驗(yàn)材料保持垂直。注意用力的時(shí)候應(yīng)使用臂力而不是手腕的力氣，時(shí)刻保持切面的濕潤，必要時(shí)需要向切面上滴加清水。徒手切片法具有簡便、迅速、易操作的優(yōu)點(diǎn)，并且容易觀察到植物組織的天然色澤與結(jié)構(gòu)。有利于研究植物解剖結(jié)構(gòu)，同時(shí)，它具有利于臨時(shí)觀察、能更快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]。

1.2.4 葉片染色方法 用番紅染液染色，將切片放入1%番紅染液染色10min，后用無水乙醇洗去浮色；再用0.1%固綠染液染近20s，用無水乙醇洗去浮色，封片觀察。用蘇木精染色，將材料放入1%蘇木精染液染色5min，后用無水乙醇洗去浮色；再用0.1%固綠染液染色近20s，用無水乙醇洗去浮色，封片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

丁香的花為傘狀花序，每個(gè)花序有小花7朵，花頂端呈傘形排列，花呈漏斗狀，花瓣有寬瓣，亦有細(xì)瓣，喇叭狀，使丁香看起來花團(tuán)錦簇。丁香的花色以淡紫色為主，并且每朵花有4片花瓣、4個(gè)雄蕊、1個(gè)雌蕊。其花粉粒飽滿，呈圓形，單粒，傳粉簡單，花期4～5月。觀賞價(jià)值極高，受到大眾喜愛。

2.2 胚珠的形態(tài)特征

利用微分離技術(shù)分離丁香花的子房可得到胚珠，其子房下位，共4室，每室有1個(gè)胚珠。丁香胚珠的形態(tài)為直生型，即珠孔與珠柄在一條直線上。屬中軸胎座，厚珠心，胚囊發(fā)育的類型為蓼型。

2.3 胚珠發(fā)育機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 胚珠的發(fā)育 受精前，胚珠由珠心、珠被、珠孔、珠柄組成，其中珠柄與胎座連接。在靠近珠心的位置逐漸生長出珠被，一般是內(nèi)珠被早于外珠被出現(xiàn)，最終珠被將珠心包圍只留下一孔，即珠孔。丁香的胚珠在發(fā)育的過程中，一般保持直生。

2.3.2 大孢子的發(fā)生大孢子的發(fā)生始于珠心表皮下分化的一個(gè)孢原細(xì)胞，這個(gè)細(xì)胞與其他細(xì)胞不同的是它的體積較大且細(xì)胞核明顯、胞質(zhì)濃厚。在厚珠心的胚珠中，孢原細(xì)胞一般進(jìn)行平周分裂，產(chǎn)生一個(gè)周緣細(xì)胞和一個(gè)造孢細(xì)胞，其中造孢細(xì)胞將起大孢子母細(xì)胞的作用，進(jìn)行減數(shù)分裂，最終形成4個(gè)單倍體數(shù)目的大孢子。通常除合點(diǎn)端的大孢子外，其余的3個(gè)大孢子逐漸退化[2]。

2.3.3 雌配子體的發(fā)育 丁香的胚囊也稱雌配子體，一般由7個(gè)細(xì)胞組成，即2個(gè)助細(xì)胞、1個(gè)卵子、1個(gè)帶有兩個(gè)極核的中央細(xì)胞、3個(gè)反足細(xì)胞。在胚囊的發(fā)育過程中，通常只有合點(diǎn)端的功能大孢子發(fā)育成胚囊，其依次經(jīng)歷細(xì)胞的體積變大、出現(xiàn)液泡、連續(xù)3次的核分裂，最終形成的8個(gè)核會(huì)處于共同的細(xì)胞質(zhì)中。因此，丁香的胚囊通常是由8個(gè)細(xì)胞核構(gòu)成7個(gè)細(xì)胞的蓼型結(jié)構(gòu)[3]。

3 結(jié)論

通過利用微分離技術(shù)對(duì)寒地丁香胚珠的發(fā)育機(jī)制的研究，確定丁香胚囊有分隔，每個(gè)隔有1個(gè)胚珠，一個(gè)胚囊共有4個(gè)胚珠。丁香為傘狀花序，花粉粒為圓形?；ǘ浞倍?，觀賞價(jià)值高[4]?；ǖ念伾珵榈仙偷凵?，花瓣的基底部為乳白色，花形狀為漏斗狀。丁香葉近心形，葉片上、下表皮細(xì)胞外壁均被有厚角質(zhì)層，氣孔器的保衛(wèi)細(xì)胞為腎形，具有發(fā)達(dá)的儲(chǔ)水組織；葉肉細(xì)胞同型，平行脈，維管束具有維管束鞘，上下表皮均有柵欄組織分布。光合作用輸送有機(jī)營養(yǎng)的能力強(qiáng)。這也驗(yàn)證了葉的生物學(xué)特征：葉片革質(zhì)，質(zhì)地硬度大的特點(diǎn)。葉的薄壁細(xì)胞分布廣泛[5]。因此，可適當(dāng)減少花的澆灌次數(shù)，便于種植。同時(shí)，也觀察到了螺紋導(dǎo)管等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，疏導(dǎo)能力較強(qiáng)。表皮層角質(zhì)層較發(fā)達(dá)。葉綠體細(xì)胞較小，丁香的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)能夠說明其具有耐陰、耐干旱等植物特性?；ǚ哿Ｐ螒B(tài)觀察結(jié)果為圓形，有待進(jìn)行深入的研究觀察丁香花粉的減數(shù)分裂行為等。丁香的根系比較發(fā)達(dá)有分支，肉質(zhì)纖維狀，利于水分和無機(jī)鹽的輸送。本項(xiàng)研究為寒地丁香種質(zhì)資源的研究提供一定的參考依據(jù)。