張崇威，邱瑾麗，李紅嬌

(1.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008；2.鄭州福源動(dòng)物藥業(yè)有限公司，鄭州 450001)

鹽酸土霉素可溶性粉為四環(huán)素類廣譜抗菌藥物制劑，能迅速抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。臨床上常用于治療豬、雞敏感大腸埃希菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及支原體引起的感染性疾病。鹽酸土霉素可溶性粉可用于產(chǎn)蛋期，治療產(chǎn)蛋率下降或停止產(chǎn)蛋，以及因輸卵管炎造成的蛋殼上帶有血跡、產(chǎn)畸形蛋和軟殼蛋、輸卵管排出黃白色膿樣分泌物等[1]。根據(jù)在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的調(diào)查，養(yǎng)殖場(chǎng)常以高于常規(guī)劑量給藥，給藥劑量為667 mg/L 50%鹽酸土霉素可溶性粉，飲水給藥，高于國家規(guī)定的500 mg/L給藥劑量。人體長(zhǎng)期攝入含少量抗生素的食品后，會(huì)造成藥物的蓄積，產(chǎn)生毒性作用，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)致癌、致畸、致突變等，因此，對(duì)食品安全帶來極大的潛在危害[2]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定了土霉素在雞蛋中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為200 μg/kg，棄蛋期2 d。目前，我國關(guān)于雞蛋中土霉素的研究主要針對(duì)殘留檢測(cè)方法的研究，包括超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、高效液相色譜法[4]、固相萃取-高效液相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法[6]等，尚未見關(guān)于鹽酸土霉素可溶性粉按國家規(guī)定劑量和增加劑量使用后在雞蛋中殘留消除規(guī)律的研究，本試驗(yàn)通過研究鹽酸土霉素可溶性粉在雞蛋中的殘留情況，確定棄蛋期前后土霉素殘留量，以期為蛋雞產(chǎn)蛋期安全用藥，保障食品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 土霉素對(duì)照品，批號(hào)：130305，中國食品藥品檢定研究院；鹽酸土霉素可溶性粉，規(guī)格：50%，生產(chǎn)批號(hào)：201708003，鄭州福源動(dòng)物藥業(yè)有限公司蘇可樂(批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字160256691)；甲醇，乙腈為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉為分析純，超純水，所需溶液配制見GB/T 21317[7]。

1.2 主要儀器 Acquity UPLC-XEVO TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；3K-30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；R215 Professional旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；IKAMS3.Basic圓周振蕩器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；ALC-2100.2電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TTL-DCⅡ氮?dú)獯蹈蓛x(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；TD系列固相萃取柱，TD-TPS-00603(天津市興達(dá)科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 試驗(yàn)選用三棚蛋雞，品種為京紅，362日齡，購自山西省陽城縣浩博養(yǎng)殖有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)，進(jìn)行常規(guī)免疫程序，試驗(yàn)前不使用任何藥物。三棚蛋雞隨機(jī)分為空白對(duì)照組(15000只)，常規(guī)劑量組(14000只)，加大劑量組(15000只)。飼喂不添加任何抗菌藥物的全價(jià)飼料，自由采食飲水。試驗(yàn)前后各組蛋雞飼養(yǎng)條件相同。

1.4 給藥和樣品采集 常規(guī)劑量組以500 mg/L，加大劑量組667 mg/L集中飲水給藥5 d，空白對(duì)照組不給藥。根據(jù)農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)醫(yī)發(fā)[2018]2號(hào)中畜禽產(chǎn)品獸藥殘留抽樣要點(diǎn)[8]，在停藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別從不同劑量組的雞棚前中后位置的產(chǎn)蛋架隨機(jī)采集雞蛋，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10個(gè)樣本，每個(gè)樣本10枚雞蛋。樣本標(biāo)記，冰箱4 ℃保存，待測(cè)。

1.5 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1×100 mm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1為即時(shí)變化，6為線性變化

1.6 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣容量800 L/h；錐孔電壓25 V；錐孔氣流速150 L/h；毛細(xì)管電壓3.3 kV；定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone volt and collision enerey

1.7 樣品前處理 用勻漿機(jī)把雞蛋制成勻漿，稱取勻質(zhì)樣品(2±0.02)g，置50 mL離心管中，加入16 mL緩沖液，漩渦震蕩20 min，14000 r/min低溫離心5 min，靜置，取上清液8 mL進(jìn)行樣品凈化。HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上述雞蛋待凈化的8 mL上清液注入萃取柱中，分別依次用3 mL水、3 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液后，用3 mL甲醇洗脫，洗脫液50 ℃水浴中氮?dú)鈨x吹干，殘?jiān)? mL 30%甲醇溶液復(fù)溶，充分混勻，殘?jiān)芤哼^0.22 μm針頭式過濾器后，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，若殘留量超出曲線范圍，以相應(yīng)空白基質(zhì)稀釋至曲線范圍。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取100 μg/L的土霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液0.02、0.05、0.08、0.10、0.20 mL于1.7項(xiàng)中氮?dú)獯蹈珊笏脷堅(jiān)?0%甲醇溶液0.98、0.95、0.92、0.90、0.80 mL，混勻，制成2、5、8、10、20 μg/kg的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次上機(jī)，以土霉素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 檢測(cè)限和定量限 取勻漿后空白雞蛋樣品2 g，添加適量的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.7項(xiàng)進(jìn)行處理，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，按信號(hào)(S)與噪音(N)比值計(jì)算，S/N>3為檢測(cè)限，S/N>10為定量限值。

1.10 精密度和準(zhǔn)確度 分別取勻漿后空白雞蛋樣品2 g，添加4、200、400 μg/kg水平的土霉素進(jìn)行回收率試驗(yàn)(按照1.7項(xiàng)進(jìn)行處理)，每個(gè)添加水平6個(gè)平行，連做3次，并計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 土霉素在2～20 μg/kg濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其曲線方程為：y=17489.07447X-2109.07021，相關(guān)系數(shù)r為0.99968，如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜如圖2。

圖2 雞蛋基質(zhì)中10 μg/kg土霉素標(biāo)準(zhǔn)液的特征色譜圖Fig 2 chromatogram of 10 μg/kg oxytetracycline standard solution in egg matrix

2.2 檢測(cè)限和定量限 根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N>3為檢測(cè)限，S/N>10為定量下限，得雞蛋中土霉素的檢測(cè)限為 2 μg/kg，定量限為 4 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 土霉素在4、200、400 μg/kg 3個(gè)添加水平上，每個(gè)添加水平做6平行，其平均回收率、日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。土霉素的回收率在79.1%～93.6%之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。圖3為空白雞蛋的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖，圖4為空白雞蛋中添加10 μg/kg的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖。

表3 土霉素回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)(n=6)Tab 3 Test of recovery rate and relative standard deviation(RSD)of Oxytetracycline(n=6)

圖3 空白雞蛋的土霉素特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 3 The characteristicion quality chromatogram of oxytetracycline in blank eggs

圖4 空白雞蛋中添加10 μg/kg土霉素的特征色譜圖Fig 4 Chromatogram of oxytetracycline (10 μg/kg)in blank eggs

2.4 雞蛋中土霉素的殘留消除 按照前處理方法對(duì)所采集的雞蛋中土霉素殘留進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。不同采樣點(diǎn)土霉素殘留量見表4，殘留消除曲線如圖5。

表4 高低劑量組雞蛋中的土霉素殘留量 Tab 4 Oxytetracycline residues in Eggs in high and low dose

圖5 雞蛋中土霉素殘留消除曲線Fig 5 Depletion curve of oxytetracycline residue in egg

空白對(duì)照組試驗(yàn)期間與各試驗(yàn)組飼養(yǎng)條件和采樣時(shí)間點(diǎn)相同，空白對(duì)照組樣品在各取樣時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)出土霉素殘留，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)期間未受到其他來源藥物的影響，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)期間土霉素殘留均來源于目的性給藥。表4結(jié)果顯示，蛋雞產(chǎn)蛋期分別按500 mg/L和667 mg/L劑量，連續(xù)5 d，每天1次，集中飲水給藥50%鹽酸土霉素可溶性粉。低劑量組在停藥第1天，土霉素殘留量最高，達(dá)到142.72 μg/kg，高劑量組殘留量為74.71 μg/kg，高劑量組在停藥第2天殘留量最高，82.84 μg/kg，與我國規(guī)定的棄蛋期2 d符合。高、低劑量組在停藥后的1～12 d，雞蛋中的土霉素殘留量均低于國家農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定的最高殘留限量(200 μg/kg)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，P>0.05，兩組差異不顯著。在臨床病情嚴(yán)重時(shí)，按標(biāo)簽最大劑量的1.33倍給藥后，不會(huì)造成土霉素在雞蛋中殘留量超標(biāo)。

3 討 論

3.1 藥物劑量的選擇 鹽酸土霉素可溶性粉是我國極少數(shù)可用于蛋雞的廣譜抗生素，因此，在臨床中常用于治療蛋雞的輸卵管炎。50%鹽酸土霉素可溶性粉根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2017年版)化學(xué)藥品卷[9]中用法用量為，以本品計(jì)每1 L水雞300～500 mg，連用3～5 d。因此,本試驗(yàn)選用標(biāo)簽中最大使用濃度500 mg/L作為常規(guī)劑量組，由于臨床使用過程中存在加大藥物使用劑量現(xiàn)象，經(jīng)在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，加大劑量一般為667 mg/L(每150 kg水100 g本品)，因此，選用667 mg/L作為加大劑量組，經(jīng)集中飲水給藥途徑，連用5 d，研究土霉素在雞蛋中的殘留水平。

3.2 藥物在雞蛋中的殘留情況 試驗(yàn)選用的兩個(gè)劑量是鹽酸土霉素可溶性粉在臨床治療輸卵管炎常用劑量，在大群養(yǎng)殖環(huán)境中，蛋雞通過集中飲水給藥，土霉素殘留情況與試驗(yàn)室研究存在一定差異。低劑量組與高劑量組在停藥3 d殘留量比停藥1 d分別下降了59.4%和20.4%，并且殘留量均較低，說明土霉素在蛋雞體內(nèi)的代謝速率相對(duì)較快，我國規(guī)定雞蛋中土霉素的最高殘留限量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)為200 μg/kg，停藥3 d低、高劑量組土霉素在雞蛋中殘留量?jī)H為最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的29%，兩個(gè)劑量組均不會(huì)造成土霉素殘留超標(biāo)。

3.3 檢測(cè)結(jié)果 不同給藥濃度雞蛋中殘留量也不同，停藥第1天，常規(guī)劑量組的殘留量高于高劑量組，停藥第2天開始，常規(guī)劑量組的檢出值均低于高劑量組。國內(nèi)文獻(xiàn)[10]曾報(bào)道高劑量組在雞蛋中的殘留量比低劑量組先達(dá)到高峰。本試驗(yàn)兩個(gè)劑量組的土霉素殘留量在停藥后的12 d中，藥物的殘留量均出現(xiàn)往復(fù)現(xiàn)象，如低劑量組停藥第6天的殘留量19.34 μg/kg，停藥第7天的殘留量25.83 μg/kg，高劑量組停藥第6天的殘留量20.48 μg/kg，停藥第7天的殘留量30.86 μg/kg。與國外文獻(xiàn)[11]報(bào)道相似：對(duì)羅德島紅雞通過飲水給予400、600、800 mg/L土霉素連續(xù)7 d，400和600 mg/L劑量組的蛋黃中土霉素殘留量在停藥第3、4天，也出現(xiàn)了殘留量升高的現(xiàn)象。

土霉素在雞蛋中殘留量出現(xiàn)往復(fù)的原因，一是由于雞蛋結(jié)構(gòu)的特殊性，藥物向蛋黃中的移行過程是向細(xì)胞內(nèi)蓄積的過程，蛋黃中的藥物殘留反映了卵泡快速生長(zhǎng)期(10 d)血漿的藥物水平，蛋黃中的藥物殘留水平因用藥時(shí)間長(zhǎng)短和開始用藥時(shí)間處于卵泡生長(zhǎng)的不同階段而升高、穩(wěn)定或下降[12]，因此,雞蛋中藥物殘留量出現(xiàn)波動(dòng)。第二個(gè)原因Kan等[13]推測(cè)是受藥物與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合率的影響，該研究在母雞的峽部和輸卵管的膨大部檢測(cè)到四環(huán)素類藥物，且四環(huán)素在輸卵管和蛋白中的殘留水平高于血液中的藥物水平，等血液中藥物濃度下降后，與蛋白質(zhì)結(jié)合的部分藥物會(huì)重新釋放出來進(jìn)入雞蛋，這也會(huì)使雞蛋中四環(huán)素類藥物的殘留量發(fā)生變化。本試驗(yàn)中土霉素在雞蛋中的殘留量雖然在后期有上升趨勢(shì)，但幅度較小，遠(yuǎn)低于國家農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定的土霉素最高殘留限量(200 μg/kg)，不會(huì)造成土霉素殘留量超標(biāo)。