張婷婷，苗嬌嬌，強(qiáng)?？?，李秀文，彭賢慧，張 雯，韓 娜

(1. 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2. 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310003)

自二十世紀(jì)四十年代抗生素作為抗感染治療的重要手段進(jìn)入臨床以來，抗生素的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，近幾十年來已全面推廣到畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于促進(jìn)動物健康生長和疾病預(yù)防。在人類和動物中，抗菌藥物過度使用，甚至濫用、誤用，導(dǎo)致細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性急劇增加，已經(jīng)發(fā)展成為全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生難題，人類健康受到極大威脅?？咕幬锬退幮允怯煽咕幬锬退幮曰?antimicrobial resistance gene, ARG)導(dǎo)致的，近年研究表明，ARG廣泛存在于自然環(huán)境中，如土壤[1]、水[2]、沉積物[3]、動物[4]和人的腸道[5]中。盡管ARG已被證明具有悠久的歷史，可以追溯到抗生素時代之前，但是抗菌藥物的使用無疑加速了其在環(huán)境-動物-人體中的傳播。在眾多的抗菌藥物類中，四環(huán)素類藥物因其價格低、作用范圍廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，曾作為一種廣譜抗生素廣泛應(yīng)用于臨床和禽畜養(yǎng)殖業(yè)[6]。然而，隨著四環(huán)素類抗生素的大量使用，細(xì)菌對其逐漸產(chǎn)生了耐藥性，治療效果大大降低，限制了四環(huán)素類抗生素在臨床上的應(yīng)用。目前，臨床僅有少量四環(huán)素類藥物用于治療非典型肺炎、牙周感染、急性盆腔炎、痤瘡等局部或全身感染[7-10]。而在獸醫(yī)和禽畜養(yǎng)殖業(yè)中，四環(huán)素類藥物仍被用作動物的抗菌促生長劑[7, 11]。自第一個耐四環(huán)素志賀痢疾桿菌(1953年)和多重耐藥志賀菌屬(1955年)發(fā)現(xiàn)以來，耐四環(huán)素菌株不斷增多，并以多重耐藥為主。細(xì)菌對四環(huán)素類藥物耐藥的機(jī)制主要是獲得編碼相關(guān)蛋白的四環(huán)素耐藥基因，目前發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類耐藥基因種類已達(dá)40多種，已知的耐藥機(jī)制主要有外排泵出機(jī)制、核糖體保護(hù)機(jī)制及產(chǎn)生滅活四環(huán)素的鈍化酶等[12]。而耐藥基因與可移動成分，如可傳遞性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子等結(jié)合，發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致四環(huán)素類耐藥基因傳播的重要因素之一，從而導(dǎo)致四環(huán)素耐藥基因廣泛分布于人源、動物源和環(huán)境源這些由細(xì)菌組成的微生態(tài)環(huán)境中[13]。

目前，四環(huán)素耐藥基因在自然界微生態(tài)環(huán)境中的分布情況尚不明確，為深入、系統(tǒng)的探索四環(huán)素類耐藥基因在人體、動物和環(huán)境微生態(tài)中的分布情況和耐藥基因多樣性，本研究擬采用宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析工具，對2 036份來自于人、動物和環(huán)境微生態(tài)的宏基因組測序樣本進(jìn)行四環(huán)素類耐藥基因研究，為臨床和畜牧業(yè)感染性疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 宏基因組數(shù)據(jù)來源 收集HMP[14]、META-HIT[15]、MG-RAST[16]和IMicrobe[17]四個公共數(shù)據(jù)庫，以及2型糖尿病研究中[18]所測得的中國健康人腸道數(shù)據(jù)的宏基因組測序樣本。HMP和META-HIT數(shù)據(jù)庫主要是關(guān)注人類微生物組；MG-RAST數(shù)據(jù)庫是一個開源數(shù)據(jù)庫，樣本來源涉及人、動物和環(huán)境；IMicrobe數(shù)據(jù)庫主要關(guān)注環(huán)境樣本的宏基因組研究；T2D-Chinese中的人類樣本是關(guān)于2型糖尿病研究[18]中的健康對照。

1.2 四環(huán)素耐藥基因來源 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)44種四環(huán)素耐藥基因，基因序列均下載于CARD耐藥數(shù)據(jù)庫[19]。

1.3 生物信息分析 基于基因序列相似度比對的方法，對來自耐藥基因數(shù)據(jù)庫CARD的44種四環(huán)素耐藥基因(tet)在人體、動物和環(huán)境中的分布進(jìn)行篩查。使用自主編寫的perl腳本對測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，然后用Bowtie2(v.2.2.6)[20]將過濾后的數(shù)據(jù)分別與44種四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行比對。reads比對長度>50 bp，且匹配reads數(shù)>10條則認(rèn)為該樣本中存在此耐藥基因，反之則認(rèn)為可能是隨機(jī)匹配，此樣本中未檢出耐藥基因。

1.4 統(tǒng)計分析方法 應(yīng)用R 3.4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異采用Fisher確切概率檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宏基因組測序樣本分布情況 共收集2 036份微生態(tài)樣本的宏基因組測序數(shù)據(jù)，均來自公共數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表的研究項(xiàng)目，分別為人1 114份，動物61份和環(huán)境861份，樣本多來自人類與環(huán)境，動物源樣本較少。詳見表1。

表1 2 036份宏基因組數(shù)據(jù)來源及類別分布情況

#：為人源樣本

2.2 不同樣本來源四環(huán)素耐藥基因分布 2 036份樣本中，910份樣本檢出四環(huán)素耐藥基因，檢出率44.70%。共檢出28種四環(huán)素耐藥基因，248份樣本至少檢出10種以上四環(huán)素耐藥基因。人源樣本中檢出率最高，達(dá)78.99%(880/1 114)，且耐藥基因分布最豐富，28種四環(huán)素類耐藥基因全部檢出，占比較大；其次是動物樣本，檢出率40.98%(25/61)，檢出6種四環(huán)素類耐藥基因；環(huán)境樣本中檢出率最低，861份樣本中僅5份(0.58%)檢出，且耐藥基因多樣性的分布比較窄，僅匹配到2種四環(huán)素類耐藥基因，分別為tetG(4份)、tetK(1份)。見圖1。

2.3 四環(huán)素不同耐藥機(jī)制的耐藥基因分布 28種四環(huán)素類耐藥基因根據(jù)耐藥機(jī)制進(jìn)行分類，結(jié)果顯示，10種為編碼核糖體保護(hù)蛋白基因(tetM、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetBP、tet32、tet36、tet44)，16種為編碼泵外排蛋白基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetG、tetK、tetL、tetAP、tetA46、tetA60、tetB46、tetB60、tet33、tet38、tet39、tet40)，以及2種編碼鈍化四環(huán)素類分子酶基因(tetX、tet37)。編碼核糖體保護(hù)蛋白基因耐藥機(jī)制占據(jù)絕對優(yōu)勢，10種基因中有5種(tetQ、tet32、tetW、tetO、tetM)在50%以上的人類樣本中檢出，其中4種在動物中也有較高的檢出率(16%以上)；而編碼泵外排蛋白基因分布較廣，基因型別最豐富，在人源樣本中廣泛分布，7種耐藥基因占比20%以上，動物源樣本中僅檢出1種耐藥基因(tet40)，同時此耐藥機(jī)制也是環(huán)境源樣本僅檢出的1種；編碼鈍化四環(huán)素類分子酶基因型別較少，且只匹配到了人類樣本上。見圖1。

2.4 不同國別四環(huán)素耐藥基因的分布 1 114份人源樣本中有776份樣本國別信息不完整，剔除此部分?jǐn)?shù)據(jù)(如HMP和IMicrobe中缺乏清楚的國別信息的樣本)，338份人源樣本具有國別信息，其中，中國74份，西班牙39份，丹麥85份，美國112份，日本28份。分析結(jié)果顯示，不同國家的微生態(tài)樣本耐藥基因分布存在很大的差異。中國來源的微生態(tài)樣本共匹配上24種四環(huán)素耐藥基因型，有5種耐藥基因型別在樣本中所占百分比為100%，即在所有中國樣本中均檢出了該耐藥基因，分別是tet32、tet40、tetO、tetQ和tetW；其次是丹麥，匹配上17種四環(huán)素耐藥基因型，tet32、tetO、tetQ和tetW四種基因型占比100%；西班牙共匹配上16種四環(huán)素耐藥基因型，tet32、tetO和tetW三種基因型占比100%；美國和日本耐藥基因型別最少，分別匹配上5種和3種四環(huán)素耐藥基因型，且耐藥率很低，基本在20%以下。同時研究發(fā)現(xiàn)，tetO、tetQ和tetW三種基因在5個國家中均有檢出，而tetL、tetS、tet33、tet36、tetA60、tetT、tet38為中國特有四環(huán)素耐藥基因。詳見圖2。

圖1 不同來源樣本中四環(huán)素耐藥基因和耐藥機(jī)制的分布

圖2 不同國別四環(huán)素耐藥基因分布情況

2.5 不同部位四環(huán)素耐藥基因分布情況 1 114份人源樣本根據(jù)采樣部位進(jìn)行分類，分為腸道、口腔、陰道、皮膚和呼吸道5大類。人體不同部位的四環(huán)素耐藥基因分布是不均勻的，腸道中的耐藥基因型分布最豐富，共有26種四環(huán)素耐藥基因匹配到腸道樣本中，其中有5種耐藥基因型所占百分比>70%，即tetQ、tetW、tetO、tet32和tet40；其次是口腔，共檢出21種四環(huán)素耐藥基因，tetM、tetQ和tet32三種耐藥基因型占比>70%；陰道和皮膚中均檢出10種耐藥基因，呼吸道中檢出9種耐藥基因，陰道、皮膚及呼吸道檢出的耐藥基因所占百分比均低于45%。見圖3。

圖3 不同部位四環(huán)素耐藥基因分布情況

3 討論

抗菌藥物的使用和細(xì)菌耐藥性是相互依存、相互制約的兩個方面。人類、動物和環(huán)境之間也不是孤立存在的，抗菌藥物耐藥基因可以通過水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間傳播，也可以通過食物和接觸的方式從動物微生態(tài)環(huán)境到人群微生態(tài)環(huán)境傳播，而生活污水、廢水，以及排泄物又造成耐藥基因從動物和人類的微生態(tài)環(huán)境向環(huán)境中進(jìn)一步傳播，環(huán)境微生態(tài)中的抗菌藥物積累到一定濃度也會通過生物鏈對人體和其他生物體構(gòu)成潛在危害。采用宏基因組學(xué)分析方法，對來源于人、動物、環(huán)境的2 036份微生態(tài)樣本的宏基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行四環(huán)素類耐藥基因篩查和耐藥機(jī)制研究，結(jié)果顯示，不同來源的微生態(tài)樣本中四環(huán)素耐藥基因分布不同，人類樣本中的耐藥基因分布最豐富，其次是動物樣本和環(huán)境樣本。人類樣本中的四環(huán)素耐藥基因最豐富，且多為多種耐藥基因并存，可能與長期以來人類抗菌藥物濫用和誤用有關(guān)。同時四環(huán)素類藥物作為動物的抗菌促生長劑，廣泛用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)，因此，在動物樣本中檢測到了高比例的四環(huán)素耐藥基因。相比于人類和動物樣本，環(huán)境樣本中耐藥基因占比很小，推測可能是由于環(huán)境樣本主要來源于海洋、大氣、土壤等，并未暴露在抗菌藥物聚集的地方；其次也可能受實(shí)驗(yàn)和測序深度的影響，造成檢出率比較低。目前，已發(fā)現(xiàn)44種四環(huán)素耐藥基因，本研究檢出28種耐藥基因，以編碼核糖體保護(hù)蛋白的耐藥機(jī)制占據(jù)主導(dǎo)，其次為編碼泵外排蛋白耐藥，且此機(jī)制耐藥基因檢出型別最多，說明四環(huán)素耐藥性的產(chǎn)生主要是由于獲得了此兩種耐藥機(jī)制編碼的四環(huán)素耐藥基因而介導(dǎo)。

同時研究發(fā)現(xiàn)，不同國家間四環(huán)素耐藥基因的分布也是不均衡的，中國、丹麥和西班牙的微生態(tài)樣本中都檢出不同類型的四環(huán)素耐藥基因，tetL、tetS、tet33、tet36、tetA60、tetT、tet38為僅在中國微生態(tài)樣本中檢出的耐藥基因，美國和日本耐藥比例相對比較低，與胡永飛等[21]研究結(jié)果一致，可能是國家的醫(yī)療制度和飲食習(xí)慣不同造成的。tetO、tetQ和tetW 3種基因在5個國家中均有檢出，說明此3種基因是四環(huán)素耐藥基因中最普遍，分布最廣的基因型。人體不同部位耐藥基因分布研究顯示，腸道和口腔微生態(tài)中的耐藥基因都很豐富，腸道中的耐藥基因型分布最普遍的是tetQ、tetW、tetO、tet32和tet40，而口腔中普遍存在的是tetM、tetQ和tet32 3種耐藥基因型。耐藥基因型差異較大，可能是人體不同部位的微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異造成的。此結(jié)果與Seville等[22]在2009年的研究結(jié)果一致，研究分析歐洲六國健康人群的糞便和唾液樣品中的四環(huán)素耐藥基因，發(fā)現(xiàn)口腔中最普遍存在的是tetM，腸道中普遍存在的依次是tetW、tetQ和tetO。人體腸道中定植著大量的微生物群體，這些正常菌群作為耐藥基因的儲存庫，不斷的將耐藥基因水平轉(zhuǎn)移給致病菌，通過與外界環(huán)境的交互作用，在人和動物中交叉?zhèn)鞑?，尤其是釋放到環(huán)境中的耐藥菌危害更嚴(yán)重，可造成耐藥基因的迅速轉(zhuǎn)移散播，因此，腸道菌群中分布最豐富，占比最高的耐藥基因應(yīng)受到足夠的重視。

研究四環(huán)素類耐藥基因在人體、動物和環(huán)境微生態(tài)中的分布情況，以及耐藥基因在不同來源、不同國別、不同人體部位的分布及耐藥機(jī)制，旨在為臨床和畜牧業(yè)等感染性疾病的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。細(xì)菌耐藥性是全世界共同關(guān)注的議題，促進(jìn)臨床合理合規(guī)使用抗菌藥物，以及減少動物例行使用抗菌藥物，是減緩人類和動物中抗藥性產(chǎn)生速度的重大措施。同時也呼吁相關(guān)部門結(jié)合環(huán)境中抗菌藥物的污染現(xiàn)狀，建立抗菌藥物環(huán)境風(fēng)險評估機(jī)制，對抗菌藥物耐藥進(jìn)行有效的監(jiān)控，提出符合我國國情的控制策略和預(yù)防措施。