方 舒，嚴(yán) 鵬，周培培

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽巢湖238000）

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，是一種能使糖原水解和催化淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖等糖類及一系列其它低聚糖的酶類，能使淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵或β-1,6糖苷鍵發(fā)生水解[1-3]。淀粉酶大部分存在于微生物和動(dòng)植物中，其中微生物的酶幾乎都是分泌的，為酶液的分離提供了便利[4]。淀粉酶制劑是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑，產(chǎn)量最多，廣泛應(yīng)用于食品加工、發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、釀造產(chǎn)業(yè)、化學(xué)工藝、飼料工業(yè)等多種領(lǐng)域[5-7]。淀粉酶是一種生物活性催化劑，需要在特定的溫度、pH等條件下才能正常發(fā)揮酶活性，為了提高淀粉酶活性，保障較高的淀粉轉(zhuǎn)化效果，研究淀粉酶的反應(yīng)條件對(duì)淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要的意義[8-9]。最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑由于淀粉的糊化溫度較高，使用的淀粉水解酶一般均需要耐受較高的溫度。溫泉是篩選嗜熱菌的微生物資源庫(kù)，從中篩選具有產(chǎn)耐熱淀粉酶的細(xì)菌幾率很大，我國(guó)科學(xué)家通過(guò)對(duì)云南騰沖溫泉中嗜熱微生物資源的多樣性研究，已篩選出大量有應(yīng)用價(jià)值的耐熱型細(xì)菌[3,10-13]。

安徽巢湖半湯溫泉系全國(guó)四大溫泉之一，大小泉眼，星羅棋布。最大的有兩口，一為燙泉，一為冷泉，兩泉匯合為溫泉，故名“半湯”。其中熱泉水溫60℃，日流量1 000噸左右，冷泉水溫40℃，日流量10 000多噸。

本研究擬對(duì)之前實(shí)驗(yàn)室篩選自巢湖半湯溫泉的一株產(chǎn)淀粉酶的嗜熱菌株CHBT-1721進(jìn)行初步的酶學(xué)性質(zhì)研究，為后期的工業(yè)化應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)[14]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

實(shí)驗(yàn)室保藏的一株篩選自巢湖半湯溫泉中的嗜熱菌株CHBT-1721。

1.1.2 培養(yǎng)基

產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基（g/1 000 mL）：蛋白胨10，牛肉膏5，可溶性淀粉2，NaCl 5，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，上述培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉即制成產(chǎn)淀粉酶固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

在超凈工作臺(tái)上用滅菌后的接種環(huán)將斜面保藏的菌株CHBT-1721經(jīng)平板劃線法接種到平板上，放入50℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)[15]。24 h后向平板的表面滴加少量盧戈氏碘液，混勻、若菌落的周圍觀察到無(wú)色透明的水解圈，說(shuō)明淀粉被水解了，則該菌株已被活化并且是產(chǎn)淀粉酶菌株[16-17]?；罨蟮木闏HBT-1721通過(guò)斜面?zhèn)鞔ǘ唐诒２赜?4℃冰箱中，備用。

1.2.2 淀粉酶活力的測(cè)定

淀粉酶活力的測(cè)定采用DNS比色法，淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉酶用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力[18]。

1.2.2.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按照表1進(jìn)行。

表1 標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液吸光度值的測(cè)定

1.2.2.1 粗酶液的制備

無(wú)菌操作接種少量菌株CHBT-1721到100 mL產(chǎn)淀粉酶液體培養(yǎng)基中，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，48 h后將上述菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液保存于潔凈離心管中，-20℃保藏備用，即為粗酶液。

酶活定義：上述條件下以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)麥芽糖單位（MMU）表示酶活性。

1.2.3 粗酶液活性與溫度、pH、金屬離子和茶堿的關(guān)系

在波長(zhǎng)為520 nm的條件下用分光光度計(jì)測(cè)定菌株CHBT-1721所提取粗酶液在溫度（30，35，40，45，50，55，60）℃、pH（3，4，5，6，7，8，9，10，11）、金屬離子（Zn2+、Mg2+、K+、Fe2+、Cu2+）和茶堿（3，6，9，12）mmol/L下的吸光度值，并根據(jù)公式計(jì)算各研究條件下的淀粉酶活力，繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶活力的測(cè)定

2.1.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，利用不同濃度的麥芽糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)測(cè)得在波長(zhǎng)為520 nm下的吸光度值，并以吸光度值為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量為橫坐標(biāo)作圖1，即為麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，公式為：

y=0.4893，x-0.0434，R2=0.9935。

圖1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 淀粉酶活力

表2 酶活力測(cè)定

2.2 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 溫度對(duì)酶活力的影響

由圖2可知淀粉酶活力的最適溫度范圍為40～50℃，淀粉酶最適反應(yīng)溫度是45℃，且溫度高于60℃時(shí)，酶活力急劇下降。

2.2.2 pH值對(duì)酶活力的影響

由圖3可知淀粉酶活力的最適pH范圍為6～8，淀粉酶最適pH是7，符合淀粉酶是胞內(nèi)酶的定性。

2.2.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖4可以看出在2 mmol/L濃度下的金屬離子對(duì)淀粉酶活性的影響，Mg2+、K+均對(duì)淀粉酶活性有促進(jìn)作用，而K+的促進(jìn)作用最大，Zn2+、Cu2+、Fe2+均對(duì)淀粉酶活性有抑制作用，而Zn2+的抑制作用最明顯。

2.2.4 茶堿對(duì)酶活力的影響

由圖5可以看出茶堿對(duì)淀粉酶有抑制作用，且隨著濃度的增加而增強(qiáng)。

圖2 不同溫度下的相對(duì)酶活

圖3 不同pH值下的相對(duì)酶活

圖4 不同金屬離子下的相對(duì)酶活

圖5 不同濃度茶堿下的相對(duì)酶活

3 結(jié)論

該研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)淀粉酶嗜熱菌株CHBT-1721的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，菌株CHBT-1721的淀粉酶活性受到溫度、pH值、金屬離子、茶堿因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度和pH值對(duì)淀粉酶活性的影響非常顯著，最適溫度和最適pH值的測(cè)定對(duì)酶的應(yīng)用研究具有重要的意義。不同菌株的生長(zhǎng)溫度不同，其所產(chǎn)淀粉酶的最適反應(yīng)活性溫度也是不一樣的，淀粉酶活性的最適pH值受酶來(lái)源影響，一般細(xì)菌來(lái)源的淀粉酶活性的pH值范圍是6～7[19]。另外不同金屬離子對(duì)淀粉酶的活性也有影響，該研究中，K+、Mg2+均有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+抑制作用較弱，Cu2+、Zn2+抑制明顯，推測(cè)Cu2+、Zn2+可以破壞酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。茶堿是黃嘌呤甲基衍生物，是一類具有顯著生理作用的生物堿存在于茶葉中，本研究中發(fā)現(xiàn)茶堿隨著濃度的增加，其抑制淀粉酶活性的作用逐漸增加，這與劉雯等[20]的研究結(jié)果也是一致的。

菌株CHBT-1721所產(chǎn)淀粉酶的反應(yīng)條件溫和適合工業(yè)生產(chǎn)，不僅對(duì)淀粉酶庫(kù)有了進(jìn)一步擴(kuò)充，而且使淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)多了一種選擇。后續(xù)擬對(duì)該酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)進(jìn)行研究，使該酶能適應(yīng)復(fù)雜的工業(yè)環(huán)境，提高該酶的應(yīng)用價(jià)值。