覃娟，謝柏艷，楊玉平，王琳，雷霽遠，彭樹翔，涂林

（武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，湖北武漢430075）

隨著生活節(jié)奏不斷加快，處于亞健康狀態(tài)的人群不斷增多，使用保健食品改善和調(diào)節(jié)人體功能也成為人們自我保健的趨勢，與日俱增的糖尿病患者對輔助降糖的保健食品需求量越來越大，但在降糖類保健食品中的非法添加降糖類化學藥物成分的現(xiàn)象卻時有發(fā)生，此舉對消費者造成了極大的隱患和危害，輕則引起毒性反應(yīng)，嚴重甚至危及生命[1-5]。為保證消費者的權(quán)益，國家食品藥品監(jiān)督管理總局先后頒布了3 個藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號為 2009029、2011008、2013001），共 4 個液相系統(tǒng)，用于輔助降血糖類中成藥及保健食品中13 種降糖類化學藥品的非法添加檢測。經(jīng)液相檢出的陽性樣品需通過一級、二級質(zhì)譜全掃描確證，但3 個批準件中的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中未注明各待測物質(zhì)的詳細質(zhì)譜條件，不便操作且效率較低[6-8]。有些降糖類保健食品采用藥物復合添加的方式，使部分降糖類化學藥物的添加濃度處于較低濃度水平[9]。含量低于液相系統(tǒng)檢出限的樣品不能被檢出，按批準件要求不再進行質(zhì)譜確證，可能出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象；某些極性物質(zhì)色譜保留時間較小，由于復雜基質(zhì)的影響，有時還是有假陽性現(xiàn)象產(chǎn)生[10]。LC-MS/MS 能夠區(qū)分或消除復雜基質(zhì)中的其他物質(zhì)的干擾，靈敏度高，分析速度快，可保證定性、定量檢測的可靠性，降低假陽性率和假陰性率[11-13]。

本文旨在研究建立一種操作簡便、快速可靠、靈敏度高LC-MS/MS 檢測方法，同時檢測保健食品中非法添加的13 種化學降糖藥的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法并用于實際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11 種降血糖保健食品：包括粉劑、膠囊劑、軟膠囊劑，6 種樣品來源于市場抽檢樣品，5 種樣品購于武漢市3 家藥房。

甲醇（色譜純）：Fisher chemical；甲酸、乙酸銨（分析純）：國藥集團。

鹽酸二甲雙胍（100922-201001）、鹽酸苯乙雙胍（100664-201203）、鹽酸羅格列酮（100673-200401）、格列吡嗪（100281-201203）、鹽酸吡格列酮（100634-201202）、格列齊特 （100269-201004）、格列波脲（520026-201401）、格列本脲（100135-201105）、格列美脲（100674-201102）、格列喹酮（100280-201002）、瑞格列奈（100753-201303）：以上對照品均來自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸丁二胍（CDAA-740015-100 mg，S0480010）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲苯磺丁脲（C17589900，G154774）：德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國ABSciex 公司；PURELAB classicMillipore/Simplicity 超純水機：Merck Millipore；XS105DU 電子天平：METTLER TOLEDO；JPCQ1028 超聲波清洗器：武漢嘉鵬電子有限公司；L530 離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

精密稱取試樣1 g 至50 mL 容量瓶中，加入甲醇適量，超聲20 min，冷卻至25 ℃，用甲醇準確定容，搖勻，3 000 r/min 離心10 min，精密量取5.0 mL 上清液至50 mL 容量瓶中，以初始流動相（甲醇∶水，體積比40 ∶60）稀釋至刻度，用 0.22 μm 濾膜濾過，上清液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.3.2 對照品溶液的配制

精密稱取13 種降糖類化學物質(zhì)對照品各10.0 mg，分別置于25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，冷卻至25 ℃，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照儲備液，置于-4 ℃冰箱中保存。臨用時，精密量取各對照儲備液1.0 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取該溶液5.0 mL 置于同一100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合標準使用液。精密量取混合標準使用液 0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分別置10 mL 容量瓶中，加初始流動相（甲醇∶水，體積比 40 ∶60）至刻度，搖勻，即得濃度為 2、5、10、20、50、100 ng/mL 混合標準系列溶液。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：島津Inertsil ODS-SP 色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相 A：10 mmol/L 乙酸銨+0.1 %甲酸水溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization positive，ESI+）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣：40 ps（i1 psi=6 895 Pa）；霧化氣：50 ps（i1 psi=6 895 Pa）；輔助加熱氣：50 psi；定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞氣能量見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

表2 保留時間和主要質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Retention time and LC-MS/MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學驗證

2.1.1 線性范圍和定量限

按照優(yōu)化好的色譜和質(zhì)譜條件測定混合標準系列溶液，以目標物的質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標，以定量離子對的峰面積y 為縱坐標，繪制標準曲線，確定方法的定量限（limits of quantitation，LOQ）?；貧w方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限見表3。

表3 線性范圍、回歸方程、定量限、加標回收率和相對標準偏差Table 3 The linear ranges，regression equations，limits of quantitation，recoveries and relative standard deviations

由表3 可見，本方法檢靈敏度高、相關(guān)性好，適用于13 種化學降糖藥物的定量分析。

2.2 色譜條件優(yōu)化

液相流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰形，還會影響到離子化效率，從而影響檢測靈敏度。經(jīng)查閱相關(guān)文獻[14-17]，本方法首先比較了甲醇-水溶液、甲醇-0.1 %甲酸水溶液 2 種流動相，結(jié)果表明在酸性條件下不僅可以提高目標物的離子化程度，還可以改善峰形，因此選取加入甲酸的流動相。進一步比較甲醇-0.1 %甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1 %甲酸）、甲醇-10 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1 %甲酸）、甲醇-20 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）4 種流動相，結(jié)果表明甲醇-10 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）為流動相時，各目標物峰型較好，響應(yīng)較高。通過不斷摸索色譜柱梯度洗脫程序，13 種目標物在15 min 內(nèi)得到很好的分離。圖1 為空白基質(zhì)樣品中添加13 種降糖類化學藥物（測得濃度為2 ng/mL）的提取離子色譜圖。

圖1 空白樣品基質(zhì)中添加13 種降糖類化學藥物（濃度為2 ng/mL）的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of a blank spiked with 13 kinds of drugs at 2 ng/mL

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于保健食品中復雜基質(zhì)的影響，質(zhì)譜檢測有時候還是有假陽性現(xiàn)象產(chǎn)生，根據(jù)歐盟委員會非強制執(zhí)行法案2002/657/EC，在使用質(zhì)譜進行確證時，需滿足最低4 個識別點數(shù)。對于低分辨四級桿質(zhì)譜，前體離子識別點數(shù)記為1，MSn每個特征子離子識別點數(shù)記為1.5，因此，需要1 個前體離子和2 個MSn子離子才能達到4 個識別點數(shù)的要求[18]。本研究結(jié)合文獻報道[19-22]，首先在電噴霧離子源正離子模式下，對13 種目標物的單標溶液進行全掃描，獲得穩(wěn)定的母離子，選取[M+H]母離子進行二級碰撞，每個化合物至少選取3 對離子進行測定，以豐度最高的子離子作為定量離子，另外兩對離子作為定性離子，13 種降糖類藥物用于確證的二級離子數(shù)目均為3 個，識別點數(shù)均為5.5，遠高于歐盟法案2002/657/EC 對于識別點數(shù)的要求，表明該方法有較強的專屬性和較好的定性能力。本研究對每種目標降糖類化學藥3 個離子對的去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)進行了優(yōu)化，最終確立了1.3.3.2 的質(zhì)譜條件。

2.4 樣品提取方法的優(yōu)化

批準件2009029 薄層色譜法、高效液相法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法都為苯乙雙胍和二甲雙胍建立單獨的樣品提取系統(tǒng)，三氯甲烷用于提取除苯乙雙胍和二甲雙胍以外的另外9 種成分，三氯甲烷提取剩余的濾渣揮干三氯甲烷后用甲醇提取苯乙雙胍和二甲雙胍，另外，三氯甲烷提取液進液相色譜儀及液相質(zhì)譜儀之前均需蒸干后加甲醇溶解，耗時且繁瑣。為減少操作步驟及獲得盡可能高的提取效率，本文優(yōu)化了超聲提取方式。分別考察了不同提取溶劑（甲醇、三氯甲烷）和不同提取時間（10、15、20、25、30 min）條件下的提取效果。結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑、超聲提取20 min 的提取效率最高，待測定成分提取完全。

2.5 實際樣品的檢測

應(yīng)用本方法對11 種降糖類保健食品進行了分析測定，結(jié)果見表4，根據(jù)歐盟委員會非強制執(zhí)行法案2002/657/EC 法案進行了定性確證。發(fā)現(xiàn)非法添加化學降糖藥物5 種，且均為復合添加。2 種樣品添加二甲雙胍，5 種樣品添加苯乙雙胍，2 種樣品添加羅格列酮，1 種樣品添加甲苯磺丁脲，1 種樣品添加吡格列酮，5 種樣品添加格列本脲；5 種樣品均為復合添加，添加2 種降糖類化學藥品的為2 種，添加3 種降糖類化學藥品的為1 種，添加4 種降糖類化學藥品的為1 種，添加5 種降糖類化學藥品的為1 種。結(jié)果表明本方法能夠滿足同時檢測宣稱輔助降血糖類保健食品中非法添加的13 種化學降糖藥物的定性和定量分析要求，基質(zhì)干擾較小，具有實際應(yīng)用意義，可及時有效的為監(jiān)管服務(wù)。

表4 樣品含量測定Table 4 Determination of 13 kinds of illegal drugs in 11 samples

續(xù)表4 樣品含量測定Continue table 4 Determination of 13 kinds of illegal drugs in 11 samples

3 結(jié)論

本文通過對方法的提取溶劑、色譜、質(zhì)譜等條件的優(yōu)化，建立了一種采用甲醇超聲提取，同時檢測保健食品中非法添加的13 種化學降糖藥的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法并用于實際檢測。該方法操作簡便、快速可靠、靈敏度高等特點，提高了降糖類中成保健食品中非法添加物檢測工作的效率，可用于監(jiān)測保健食品中添加降糖類化學藥物的情況，為市場監(jiān)管提供強有力的技術(shù)支持；對保證消費者用藥安全具有較強的現(xiàn)實意義。